Nucleostemin基因及PCNA在非小细胞肺癌组织中的检测及意义

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  【摘要】 目的:探讨Nucleostemin基因及PCNA在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的检测及意义。方法:采用免疫组织化学SP法对53例NSCLC患者的非小细胞肺癌组织和15例癌旁正常者的组织中NS蛋白进行检测,并对其与NSCLC患者临床病理特征关系进行分析。结果:NS蛋白在NSCLC中的表达率为54.7%(29/53)明显高于癌旁正常组织中的表达率0(0/15),NS蛋白腺癌组织的表达率为65.2%(15/23)明显高于鳞癌组织的表达率46.7%(14/30),高、中分化组织的表达率42.9%(15/35)明显低于低分化组织的表达率77.8%(14/18),比较差异均有统计学意义(P<0.05),与患者TNM分期及淋巴结转移无关(P>0.05)。NSCLC组织中PCNA阳性率71.7%(38/53)明显高于癌旁正常组织6.7%(1/15),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:NSCLC患者非小细胞肺癌组织中,NS基因mRNA和蛋白存在明显的高表达趋势,PCNA阳性率显著增高,有利于肿瘤细胞恶性增殖,因而是一种临床应用价值较高的肿瘤分子标志物。
  【关键词】 非小细胞肺癌; 基因; 核干细胞因子; 免疫组织化学
  肺癌是临床上较为常见的一种恶性肿瘤,该疾病所导致的死亡率和发病率都呈现出了明显的上升趋势。NS属于一种p53结合蛋白,主要存在于肿瘤、变异细胞和干细胞之中,有助于肿瘤细胞和干细胞继续增殖作用的维持[1]。而未获得NSCLC的清除表达的情况下,NS表达量的提高会受到多种肿瘤恶性程度的影响。本次临床研究通过免疫组织化学SP法对NS基因在NSCLC和癌旁正常组织中的表达进行了检测和分析,现将本次临床研究结果报告如下。
  1 资料与方法
  1.1 一般资料 选取2010年1月-2012年1月在本院接受手术治疗且病理检查证实为非小细胞肺癌的53例患者为观察对象,男31例,女22例,年龄37~76岁,平均(75±12.3)岁。其中腺癌23例,鳞癌30例。所有患者术前均未接受放疗和化疗治疗。患者组织学分级结果为:低分化18例,中分化25例,高分化10例。依据国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM分期标准,Ⅲ期15例,Ⅱ期34例,Ⅰ期4例。同时选择15例癌旁(>4 cm)经病理证实的正常肺组织作为对照组。
  1.2 方法 本次临床研究选用北京中山生物技术有限公司生产的SP试剂盒和兔抗人FHIT多克隆抗体,所有患者均在正常组织切缘或原发灶癌组织中获取组织样品,使用10%福尔马林将组织固定,4 μm连续切片,石蜡包埋,并同时实施免疫组化SP法染色和HE染色。免疫组织化学NS基因蛋白表达的具体检测方法为:连续切片组织蜡块,厚度控制为4 Lm,组织样品常规脱蜡至水,并使用pH为6.1的枸橼酸盐缓冲液0.101 mmol/L微波热修复组织样品。其余免疫组化染色严格执行试剂盒相关说明。鼠抗人NS抗体行1B100稀释,浓度控制在10 Lg/mL左右,37 ℃中连续孵育2.5 h,使用DAB进行显色处理,通过显微镜对反应时间进行控制,显色过程通过自来水终止,复染苏木精。所有染色均设置阴性和阳性对照,阳性对照为已知的阳性组织切片,阴性对照为PBS替代一抗。随机选择5个视野,在高倍镜下观察NS蛋白阳性表达定位于细胞质,每个视野选择200个细胞进行计算,共计算1000个细胞。
  1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 两组NS蛋白表达率比较 癌旁正常组织中NS蛋白的表达率为0(0/15),而NSCLC组织中NS蛋白的表达率达到54.7%(29/53),癌旁正常组织中NS蛋白的表达率明显低于NSCLC组织,比较差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.2 鳞癌组织和腺癌组织中NS蛋白表达率比较 鳞癌组织中NS蛋白表达率仅为46.7%(14/30),而腺癌组织中NS蛋白表达率达到65.2%(15/23),腺癌组织中NS蛋白表达率明显高于鳞癌组织,比较差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.3 高、中分化组织和低分化组织中NS蛋白表达率比较 高、中分化组织中NS蛋白表达率为42.9%(15/35),而低分化组织中NS蛋白表达率为77.8%(14/18),高、中分化组织中NS蛋白表达率明显低于低分化组织,比较差异均有统计学意义(P<0.05),同时,患者的淋巴结转移情况以及TNM分期结果对其NS蛋白表达率无明显影响(P>0.05)。
  2.4 两组间PCNA表达情况 PCNA均在细胞核中以均匀分布方式进行表达,阳性表达标准是细胞核内出现棕黄色颗粒物。所有均于细胞核中均匀分布,阳性表达为细胞核中有出现。癌旁正常组织PCNA阳性率为6.7%(1/15),NSCLC组织中PCNA阳性率为71.7%(38/53),对比可知,NSCLC患者PCNA阳性率显著高于癌旁正常组织,比较差异有统计学意义(P<0.05)。
  3 讨论
  正常的细胞组织经过一系列多阶段、长时间的演变,会逐渐形成一种疾病状态,进而发展称为肿瘤细胞,在这一复杂且漫长的演变过程中,很多细胞蛋白和基因等物质都会起到十分重要的作用[2]。医学研究结果证实,NS蛋白能够利用p53通路来对细胞周期产生调节作用,从而对细胞的分化和增殖产生直接影响,NS蛋白表达率通过通过杂合子基因敲出和RNA干扰实验等过程逐渐降低,进而提高细胞的衰老速度,控制细胞增殖,所以,医学上常将NS蛋白视为调节细胞增殖过程的主要因素。近年来的医学研究结果表明,在蛋白水平和RNA方面,NS在多种原发癌和肿瘤细胞系中为高表达状态,而在定型终末分化细胞中则无表达[3]。
  肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性,而PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。因此,国内外在许多肿瘤中进行了PCNA的研究,涉及PCNA与肿瘤发生发展、分级、分期、放疗敏感性、预后、复发和转移、死亡原因、肿瘤标志物等各个方面的相关性,得出了许多结论。PCNA是一种细胞周期蛋白,作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与细胞增殖过程中的DNA复制,其合成和表达与细胞增殖周期相关。在细胞周期的G1期和S期早期合成,S期达高峰,G2期下降,核分裂期最低,故能反映全部细胞的增殖情况,代表细胞增殖状态。PCNA表达异常可引起细胞周期的失控,是细胞异常增殖和癌变的原因之一。   本次临床研究结果显示,癌旁正常组织中NS蛋白表达明显低于NSCLC组织。NS高表达的可能原因在于NSCLC所导致的早期事件,NSCLC组织中NS蛋白高表达,会提高细胞组织能力,并导致其发生癌变,逐步增强正常组织细胞转化为恶性的能力,最终诱发恶性肿瘤[4-5]。由此可知,在NSCLC发生过程中,NS蛋白表达减少具有一定的影响,通过免疫组化检测技术与纤维支气管镜活检相结合的方式获得NS蛋白表达,有助于早期发现NSCLC,进而有助于NSCLC早期诊断率的提高[6]。另一方面,NSCLC的分化程度与NS蛋白表达无直接联系,高中分化组织中NS蛋白表达明显低于低分化组织,且NS蛋白表达率越高,组织分化程度越低。因为肿瘤细胞存在NS担保高表达现象,并导致肿瘤细胞在G2/M和G1/S、两个细胞周期阶段跃迁,在肿瘤细胞的细胞周期循环过程中,细胞会逐渐增殖,进而会阻断细胞的深入分化,提高细胞的有丝分裂速度。在细胞恶性增殖过程中,NS基因具有十分重要的作用,因而能够将NS高表达视为肿瘤细胞恶性程度的评价指标[7]。另一方面,NSCLC患者PCNA阳性率显著高于癌旁正常组织(P<0.05),由此可见,PCNA表达可直接反映肿瘤细胞DNA复制活跃程度,在肿瘤恶性程度判定中具有重要价值。NSCLC患者肺癌分化程度、淋巴结转移与否和PCNA阳性表达水平间关系密切[8-10],因此PCNA表达可对肺癌患者展开个体化治疗发挥有效指导作用,同时在判断肿瘤预后质量中有重要意义。
  综上所述,NSCLC患者非小细胞肺癌组织中,NS基因mRNA和蛋白存在明显的高表达趋势,PCNA阳性率显著增高,有利于肿瘤细胞恶性增殖,因而是一种临床应用价值较高的肿瘤分子标志物。
  参考文献
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  (收稿日期:2013-08-18) (本文编辑:欧丽)
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