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【摘要】 目的：探讨Nucleostemin基因及PCNA在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的检测及意义。方法：采用免疫组织化学SP法对53例NSCLC患者的非小细胞肺癌组织和15例癌旁正常者的组织中NS蛋白进行检测，并对其与NSCLC患者临床病理特征关系进行分析。结果：NS蛋白在NSCLC中的表达率为54.7%（29/53）明显高于癌旁正常组织中的表达率0（0/15），NS蛋白腺癌组织的表达率为65.2%（15/23）明显高于鳞癌组织的表达率46.7%（14/30），高、中分化组织的表达率42.9%（15/35）明显低于低分化组织的表达率77.8%（14/18），比较差异均有统计学意义（P<0.05），与患者TNM分期及淋巴结转移无关（P>0.05）。NSCLC组织中PCNA阳性率71.7%（38/53）明显高于癌旁正常组织6.7%（1/15），差异有统计学意义（P<0.05）。结论：NSCLC患者非小细胞肺癌组织中，NS基因mRNA和蛋白存在明显的高表达趋势，PCNA阳性率显著增高，有利于肿瘤细胞恶性增殖，因而是一种临床应用价值较高的肿瘤分子标志物。
【关键词】 非小细胞肺癌； 基因； 核干细胞因子； 免疫组织化学
肺癌是临床上较为常见的一种恶性肿瘤，该疾病所导致的死亡率和发病率都呈现出了明显的上升趋势。NS属于一种p53结合蛋白，主要存在于肿瘤、变异细胞和干细胞之中，有助于肿瘤细胞和干细胞继续增殖作用的维持[1]。而未获得NSCLC的清除表达的情况下，NS表达量的提高会受到多种肿瘤恶性程度的影响。本次临床研究通过免疫组织化学SP法对NS基因在NSCLC和癌旁正常组织中的表达进行了检测和分析，现将本次临床研究结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2010年1月-2012年1月在本院接受手术治疗且病理检查证实为非小细胞肺癌的53例患者为观察对象，男31例，女22例，年龄37～76岁，平均（75±12.3）岁。其中腺癌23例，鳞癌30例。所有患者术前均未接受放疗和化疗治疗。患者组织学分级结果为：低分化18例，中分化25例，高分化10例。依据国际抗癌联盟（UICC）制定的TNM分期标准，Ⅲ期15例，Ⅱ期34例，Ⅰ期4例。同时选择15例癌旁（>4 cm）经病理证实的正常肺组织作为对照组。
1.2 方法 本次临床研究选用北京中山生物技术有限公司生产的SP试剂盒和兔抗人FHIT多克隆抗体，所有患者均在正常组织切缘或原发灶癌组织中获取组织样品，使用10%福尔马林将组织固定，4 μm连续切片，石蜡包埋，并同时实施免疫组化SP法染色和HE染色。免疫组织化学NS基因蛋白表达的具体检测方法为：连续切片组织蜡块，厚度控制为4 Lm，组织样品常规脱蜡至水，并使用pH为6.1的枸橼酸盐缓冲液0.101 mmol/L微波热修复组织样品。其余免疫组化染色严格执行试剂盒相关说明。鼠抗人NS抗体行1B100稀释，浓度控制在10 Lg/mL左右，37 ℃中连续孵育2.5 h，使用DAB进行显色处理，通过显微镜对反应时间进行控制，显色过程通过自来水终止，复染苏木精。所有染色均设置阴性和阳性对照，阳性对照为已知的阳性组织切片，阴性对照为PBS替代一抗。随机选择5个视野，在高倍镜下观察NS蛋白阳性表达定位于细胞质，每个视野选择200个细胞进行计算，共计算1000个细胞。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组NS蛋白表达率比较 癌旁正常组织中NS蛋白的表达率为0（0/15），而NSCLC组织中NS蛋白的表达率达到54.7%（29/53），癌旁正常组织中NS蛋白的表达率明显低于NSCLC组织，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 鳞癌组织和腺癌组织中NS蛋白表达率比较 鳞癌组织中NS蛋白表达率仅为46.7%（14/30），而腺癌组织中NS蛋白表达率达到65.2%（15/23），腺癌组织中NS蛋白表达率明显高于鳞癌组织，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 高、中分化组织和低分化组织中NS蛋白表达率比较 高、中分化组织中NS蛋白表达率为42.9%（15/35），而低分化组织中NS蛋白表达率为77.8%（14/18），高、中分化组织中NS蛋白表达率明显低于低分化组织，比较差异均有统计学意义（P<0.05），同时，患者的淋巴结转移情况以及TNM分期结果对其NS蛋白表达率无明显影响（P>0.05）。
2.4 两组间PCNA表达情况 PCNA均在细胞核中以均匀分布方式进行表达，阳性表达标准是细胞核内出现棕黄色颗粒物。所有均于细胞核中均匀分布，阳性表达为细胞核中有出现。癌旁正常组织PCNA阳性率为6.7%（1/15），NSCLC组织中PCNA阳性率为71.7%（38/53），对比可知，NSCLC患者PCNA阳性率显著高于癌旁正常组织，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
正常的细胞组织经过一系列多阶段、长时间的演变，会逐渐形成一种疾病状态，进而发展称为肿瘤细胞，在这一复杂且漫长的演变过程中，很多细胞蛋白和基因等物质都会起到十分重要的作用[2]。医学研究结果证实，NS蛋白能够利用p53通路来对细胞周期产生调节作用，从而对细胞的分化和增殖产生直接影响，NS蛋白表达率通过通过杂合子基因敲出和RNA干扰实验等过程逐渐降低，进而提高细胞的衰老速度，控制细胞增殖，所以，医学上常将NS蛋白视为调节细胞增殖过程的主要因素。近年来的医学研究结果表明，在蛋白水平和RNA方面，NS在多种原发癌和肿瘤细胞系中为高表达状态，而在定型终末分化细胞中则无表达[3]。
肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。因此，国内外在许多肿瘤中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展、分级、分期、放疗敏感性、预后、复发和转移、死亡原因、肿瘤标志物等各个方面的相关性，得出了许多结论。PCNA是一种细胞周期蛋白，作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与细胞增殖过程中的DNA复制，其合成和表达与细胞增殖周期相关。在细胞周期的G1期和S期早期合成，S期达高峰，G2期下降，核分裂期最低，故能反映全部细胞的增殖情况，代表细胞增殖状态。PCNA表达异常可引起细胞周期的失控，是细胞异常增殖和癌变的原因之一。 本次临床研究结果显示，癌旁正常组织中NS蛋白表达明显低于NSCLC组织。NS高表达的可能原因在于NSCLC所导致的早期事件，NSCLC组织中NS蛋白高表达，会提高细胞组织能力，并导致其发生癌变，逐步增强正常组织细胞转化为恶性的能力，最终诱发恶性肿瘤[4-5]。由此可知，在NSCLC发生过程中，NS蛋白表达减少具有一定的影响，通过免疫组化检测技术与纤维支气管镜活检相结合的方式获得NS蛋白表达，有助于早期发现NSCLC，进而有助于NSCLC早期诊断率的提高[6]。另一方面，NSCLC的分化程度与NS蛋白表达无直接联系，高中分化组织中NS蛋白表达明显低于低分化组织，且NS蛋白表达率越高，组织分化程度越低。因为肿瘤细胞存在NS担保高表达现象，并导致肿瘤细胞在G2/M和G1/S、两个细胞周期阶段跃迁，在肿瘤细胞的细胞周期循环过程中，细胞会逐渐增殖，进而会阻断细胞的深入分化，提高细胞的有丝分裂速度。在细胞恶性增殖过程中，NS基因具有十分重要的作用，因而能够将NS高表达视为肿瘤细胞恶性程度的评价指标[7]。另一方面，NSCLC患者PCNA阳性率显著高于癌旁正常组织（P<0.05），由此可见，PCNA表达可直接反映肿瘤细胞DNA复制活跃程度，在肿瘤恶性程度判定中具有重要价值。NSCLC患者肺癌分化程度、淋巴结转移与否和PCNA阳性表达水平间关系密切[8-10]，因此PCNA表达可对肺癌患者展开个体化治疗发挥有效指导作用，同时在判断肿瘤预后质量中有重要意义。
综上所述，NSCLC患者非小细胞肺癌组织中，NS基因mRNA和蛋白存在明显的高表达趋势，PCNA阳性率显著增高，有利于肿瘤细胞恶性增殖，因而是一种临床应用价值较高的肿瘤分子标志物。
参考文献
[1]毛友生.BCRP基因在非小细胞肺癌组织和非癌肺组织中的表达及意义[J].癌症，2001，20（3）：274-275.
[2]李莉，曹博金，王丽娜，等.Linvin基因在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学，2010，18（12）：2367-2368.
[3]李娟，李友伦，程序.Nucleostemin基因在非小细胞非癌组织中的表达及意义[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2010，19（3）：230-231.
[4]童秀珍，邹外一，卜珊珊，等.急性白血病患者骨髓细胞nucleostemin基因的表达与其类型、疗效的关系[J].中国病理生理杂志，2008，24（11）：2171-2172.
[5]李向阳，钱如林，蔡祖勋，等.Nucleostemin 基因在非小细胞肺癌组织中的检测及意义[J].中国实用医药，2012，7（18）：127-128.
[6]翁米霞，吴翠环，杨秀萍.E2cadhe rin，CD44v6和PCNA在非小细胞肺癌组织中的表达及意义[J].癌症，2008，27（2）：191-195.
[7]蔡紫薇，郑学智.乳腺肿瘤组织nucleostemin基因表达与临床病理表现的关系[J].中国病理生理杂志，2007，23（11）：2191-2192.
[8]赵阳，李晓军，隋昕，等.PCNA和Caspase-3在肺癌组织中的表达及意义[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，26（2）：23-25.
[9]赖习华，王茂生，陈小萍，等.C-myc与PCNA在肺癌组织中的表达及其意义[J].现代肿瘤医学，2011，19（8）：1583-1585.
[10] Keller U，Huber J，Nilsson J A，et al.Myc suppression of Nfkb2 accelerates lymphomagenesis[J].BMC Cancer，2010，10（1）：348.
（收稿日期：2013-08-18） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 非小细胞肺癌； 基因； 核干细胞因子； 免疫组织化学
肺癌是临床上较为常见的一种恶性肿瘤，该疾病所导致的死亡率和发病率都呈现出了明显的上升趋势。NS属于一种p53结合蛋白，主要存在于肿瘤、变异细胞和干细胞之中，有助于肿瘤细胞和干细胞继续增殖作用的维持[1]。而未获得NSCLC的清除表达的情况下，NS表达量的提高会受到多种肿瘤恶性程度的影响。本次临床研究通过免疫组织化学SP法对NS基因在NSCLC和癌旁正常组织中的表达进行了检测和分析，现将本次临床研究结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2010年1月-2012年1月在本院接受手术治疗且病理检查证实为非小细胞肺癌的53例患者为观察对象，男31例，女22例，年龄37～76岁，平均（75±12.3）岁。其中腺癌23例，鳞癌30例。所有患者术前均未接受放疗和化疗治疗。患者组织学分级结果为：低分化18例，中分化25例，高分化10例。依据国际抗癌联盟（UICC）制定的TNM分期标准，Ⅲ期15例，Ⅱ期34例，Ⅰ期4例。同时选择15例癌旁（>4 cm）经病理证实的正常肺组织作为对照组。
1.2 方法 本次临床研究选用北京中山生物技术有限公司生产的SP试剂盒和兔抗人FHIT多克隆抗体，所有患者均在正常组织切缘或原发灶癌组织中获取组织样品，使用10%福尔马林将组织固定，4 μm连续切片，石蜡包埋，并同时实施免疫组化SP法染色和HE染色。免疫组织化学NS基因蛋白表达的具体检测方法为：连续切片组织蜡块，厚度控制为4 Lm，组织样品常规脱蜡至水，并使用pH为6.1的枸橼酸盐缓冲液0.101 mmol/L微波热修复组织样品。其余免疫组化染色严格执行试剂盒相关说明。鼠抗人NS抗体行1B100稀释，浓度控制在10 Lg/mL左右，37 ℃中连续孵育2.5 h，使用DAB进行显色处理，通过显微镜对反应时间进行控制，显色过程通过自来水终止，复染苏木精。所有染色均设置阴性和阳性对照，阳性对照为已知的阳性组织切片，阴性对照为PBS替代一抗。随机选择5个视野，在高倍镜下观察NS蛋白阳性表达定位于细胞质，每个视野选择200个细胞进行计算，共计算1000个细胞。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组NS蛋白表达率比较 癌旁正常组织中NS蛋白的表达率为0（0/15），而NSCLC组织中NS蛋白的表达率达到54.7%（29/53），癌旁正常组织中NS蛋白的表达率明显低于NSCLC组织，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 鳞癌组织和腺癌组织中NS蛋白表达率比较 鳞癌组织中NS蛋白表达率仅为46.7%（14/30），而腺癌组织中NS蛋白表达率达到65.2%（15/23），腺癌组织中NS蛋白表达率明显高于鳞癌组织，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 高、中分化组织和低分化组织中NS蛋白表达率比较 高、中分化组织中NS蛋白表达率为42.9%（15/35），而低分化组织中NS蛋白表达率为77.8%（14/18），高、中分化组织中NS蛋白表达率明显低于低分化组织，比较差异均有统计学意义（P<0.05），同时，患者的淋巴结转移情况以及TNM分期结果对其NS蛋白表达率无明显影响（P>0.05）。
2.4 两组间PCNA表达情况 PCNA均在细胞核中以均匀分布方式进行表达，阳性表达标准是细胞核内出现棕黄色颗粒物。所有均于细胞核中均匀分布，阳性表达为细胞核中有出现。癌旁正常组织PCNA阳性率为6.7%（1/15），NSCLC组织中PCNA阳性率为71.7%（38/53），对比可知，NSCLC患者PCNA阳性率显著高于癌旁正常组织，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
正常的细胞组织经过一系列多阶段、长时间的演变，会逐渐形成一种疾病状态，进而发展称为肿瘤细胞，在这一复杂且漫长的演变过程中，很多细胞蛋白和基因等物质都会起到十分重要的作用[2]。医学研究结果证实，NS蛋白能够利用p53通路来对细胞周期产生调节作用，从而对细胞的分化和增殖产生直接影响，NS蛋白表达率通过通过杂合子基因敲出和RNA干扰实验等过程逐渐降低，进而提高细胞的衰老速度，控制细胞增殖，所以，医学上常将NS蛋白视为调节细胞增殖过程的主要因素。近年来的医学研究结果表明，在蛋白水平和RNA方面，NS在多种原发癌和肿瘤细胞系中为高表达状态，而在定型终末分化细胞中则无表达[3]。
肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。因此，国内外在许多肿瘤中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展、分级、分期、放疗敏感性、预后、复发和转移、死亡原因、肿瘤标志物等各个方面的相关性，得出了许多结论。PCNA是一种细胞周期蛋白，作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与细胞增殖过程中的DNA复制，其合成和表达与细胞增殖周期相关。在细胞周期的G1期和S期早期合成，S期达高峰，G2期下降，核分裂期最低，故能反映全部细胞的增殖情况，代表细胞增殖状态。PCNA表达异常可引起细胞周期的失控，是细胞异常增殖和癌变的原因之一。 本次临床研究结果显示，癌旁正常组织中NS蛋白表达明显低于NSCLC组织。NS高表达的可能原因在于NSCLC所导致的早期事件，NSCLC组织中NS蛋白高表达，会提高细胞组织能力，并导致其发生癌变，逐步增强正常组织细胞转化为恶性的能力，最终诱发恶性肿瘤[4-5]。由此可知，在NSCLC发生过程中，NS蛋白表达减少具有一定的影响，通过免疫组化检测技术与纤维支气管镜活检相结合的方式获得NS蛋白表达，有助于早期发现NSCLC，进而有助于NSCLC早期诊断率的提高[6]。另一方面，NSCLC的分化程度与NS蛋白表达无直接联系，高中分化组织中NS蛋白表达明显低于低分化组织，且NS蛋白表达率越高，组织分化程度越低。因为肿瘤细胞存在NS担保高表达现象，并导致肿瘤细胞在G2/M和G1/S、两个细胞周期阶段跃迁，在肿瘤细胞的细胞周期循环过程中，细胞会逐渐增殖，进而会阻断细胞的深入分化，提高细胞的有丝分裂速度。在细胞恶性增殖过程中，NS基因具有十分重要的作用，因而能够将NS高表达视为肿瘤细胞恶性程度的评价指标[7]。另一方面，NSCLC患者PCNA阳性率显著高于癌旁正常组织（P<0.05），由此可见，PCNA表达可直接反映肿瘤细胞DNA复制活跃程度，在肿瘤恶性程度判定中具有重要价值。NSCLC患者肺癌分化程度、淋巴结转移与否和PCNA阳性表达水平间关系密切[8-10]，因此PCNA表达可对肺癌患者展开个体化治疗发挥有效指导作用，同时在判断肿瘤预后质量中有重要意义。
综上所述，NSCLC患者非小细胞肺癌组织中，NS基因mRNA和蛋白存在明显的高表达趋势，PCNA阳性率显著增高，有利于肿瘤细胞恶性增殖，因而是一种临床应用价值较高的肿瘤分子标志物。
参考文献
[1]毛友生.BCRP基因在非小细胞肺癌组织和非癌肺组织中的表达及意义[J].癌症，2001，20（3）：274-275.
[2]李莉，曹博金，王丽娜，等.Linvin基因在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学，2010，18（12）：2367-2368.
[3]李娟，李友伦，程序.Nucleostemin基因在非小细胞非癌组织中的表达及意义[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2010，19（3）：230-231.
[4]童秀珍，邹外一，卜珊珊，等.急性白血病患者骨髓细胞nucleostemin基因的表达与其类型、疗效的关系[J].中国病理生理杂志，2008，24（11）：2171-2172.
[5]李向阳，钱如林，蔡祖勋，等.Nucleostemin 基因在非小细胞肺癌组织中的检测及意义[J].中国实用医药，2012，7（18）：127-128.
[6]翁米霞，吴翠环，杨秀萍.E2cadhe rin，CD44v6和PCNA在非小细胞肺癌组织中的表达及意义[J].癌症，2008，27（2）：191-195.
[7]蔡紫薇，郑学智.乳腺肿瘤组织nucleostemin基因表达与临床病理表现的关系[J].中国病理生理杂志，2007，23（11）：2191-2192.
[8]赵阳，李晓军，隋昕，等.PCNA和Caspase-3在肺癌组织中的表达及意义[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，26（2）：23-25.
[9]赖习华，王茂生，陈小萍，等.C-myc与PCNA在肺癌组织中的表达及其意义[J].现代肿瘤医学，2011，19（8）：1583-1585.
[10] Keller U，Huber J，Nilsson J A，et al.Myc suppression of Nfkb2 accelerates lymphomagenesis[J].BMC Cancer，2010，10（1）：348.
（收稿日期：2013-08-18） （本文编辑：欧丽）