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【摘 要】头孢曲松钠属第三代头孢菌素，具广谱抗菌作用.本实验对注射用头孢曲松钠无菌检查方法进行验证验证。方法：采用薄膜过滤法以500ml/筒缓冲液冲洗量检查，结果：头孢曲松钠对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。
【关键词】注射用头孢曲松钠；无菌检查；验证
头孢曲松钠属第三代头孢菌素，具广谱抗菌作用，对流感嗜血杆菌、肠杆菌科细菌、淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌有较强抗菌作用，对阴沟肠杆菌、不动杆菌属和铜绿假单胞菌作用较差[1-5]。头孢曲松钠化学名为[6R-[6a，7b（Z）]]-7[[2，3-二氢-2-亚氨基-4-噻唑基）（甲氧亚氨基）乙酰基]氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂二环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸钠盐[6-8]。头孢曲松钠常用于肺炎、烧伤感染、腹膜炎、支气管炎、尿道感染、败血症、脑膜炎、皮肤及伤口的感染、胃肠道感染、肺化脓症、肾脏感染、生殖器感染等[9-10]。无菌检查采用薄膜过滤法是取样量较大的集菌方法，具有代表性，不易漏检等特点[11-13]。本实验对注射用头孢曲松钠无菌检查方法进行验证验证。
1.试验环境与材料
1.1试验环境
在环境洁净度为B+A的无菌室中进行。
1.2仪器
NKF330一次性全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、HTY-601智能集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）、HY-2（A）调速多用振荡器（常州华冠仪器制造有限公司）、SPX-250智能生化培养箱（常州华冠仪器制造有限公司）、MJX-150B智能霉菌培养箱（常州华冠仪器制造有限公司）、YXQ-LS-30SII高压灭菌锅（西安常仪仪器设备有限公司）、FB224电子分析天平（江苏淮安翔宇电子衡器公司）。
1.3试验用菌株
生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）、白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]（第4代）、大肠埃希菌ECMCC（B）44lO23（第3代）、黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）。
1.4培养基、稀释液及缓冲液
1.4.1干粉培养基
硫乙醇酸盐培养基（湖北鑫润德化工有限公司）、改良马丁琼脂培养基（威海新月化玻仪器有限公司）、改良马丁培养基（上海研域生物科技有限公司）、玫瑰红钠琼脂培养基（上海研域生物科技有限公司）、营养琼脂培养基（威海新月化玻仪器有限公司）。
1.4.2细菌稀释液
氯化钠溶液（广州百特医疗用品有限公司）。
1.4.3冲洗用缓冲液
pH 7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液（上海研域生物科技有限公司）。
2.方法与结果
2.1菌液制备
（1）取经30℃～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，备用。
（2）取经30℃～35℃培养18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-7备用。
（3）取经23℃～28℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6，备用。
（4）取经23℃～28℃培养5～7天的黑曲霉斜面培养物，加3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，备用。
2.2菌液计数
每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml，注入约15毫升、45摄氏度改良马丁琼脂平皿，经26摄氏度生化培养箱培养72小时，金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液、大肠埃希菌液各1ml，注入约15 毫升、45摄氏度营养琼脂平皿，经36摄氏度生化培养箱培养48小时，活菌计数。生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）菌落数78cfu/ml，白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）菌落数65cfu/ml，金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）菌落数75cfu/ml，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]（第4代）菌落数，69cfu/ml，大肠埃希菌ECMCC （B）44lO23（第3代）菌落数82cfu/ml，黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）菌落数62cfu/ml。
2.3方法的验证采用薄膜过滤法
2.3.1供试液制备
取供试品15支溶于500ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于七个滤筒中过滤，冲洗液用量为每筒500ml，每次50ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液（约为10～100个/筒），依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基，按规定条件培养14天。逐日观察。
2.3.2对照组
另取7个滤筒，分别加入1ml相应的试验菌，再加入相应等量培养基，作为对照，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.3供试品对照组
取供试品15支，溶于500ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于2个滤筒中过滤，冲洗滤膜数次，每次50ml，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2010年版《中国药典》二部无菌检查法，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.4空白对照组 取试验用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.5阴性对照组
取冲洗用0.1%蛋白胨缓冲液及0.9%的无菌氯化钠溶液适量，分置于两个滤筒中过滤，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.6培养
硫乙醇酸盐流体培养基桶30～35℃培养；真菌培养基桶23～28℃培养，培养 14d。每天观察并记录。
结果表明，头孢曲松钠对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。注射用头孢曲松钠采用薄膜过滤法进行无菌检查时，缓冲液冲洗量以500ml/筒为宜，可以选择大肠埃希菌或金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。
【参考文献】
[1]张昕，黄文静，张肖群.注射用头孢呋辛钠溶液颜色检查不合格测定结果分析[J].今日药学，2010（02）.
[2]李军，黄萍，谢元超，于力，单红宾.用HPLC法测定头孢曲松钠、头孢噻肟钠、头孢哌酮钠聚合物[J].中国药品标准，2002（03）.
[3]江晓玲，刘昆，邓俊丰，李波.头孢菌素类抗生素中高分子杂质的研究进展[J].国外医药（抗生素分册），2007（06）.
[4]魏农农.创新性化学药物杂质研究目的、思路与技术要求[J].中国新药杂志，2008（16）.
[5]张春桃，王静康，王永莉.头孢曲松钠结晶工艺研究进展[J].中国抗生素杂志，2006（07）.
[6]刘浩，仇士林.头孢曲松钠HPLC法含量测定[J].中国抗生素杂志，2002（05）.
[7]李艳枫，王晶.头孢曲松钠生产工艺与色级的关系[J].黑龙江医药，2010（02）.
[8]戎晓娟，肖丹，王炜，张春然，杨红.头孢菌素中间体GCLE的主要相关杂质研究[J].中国抗生素杂志，2009（03）.
[9]李方，胡燕锋，陈敏玲.高效液相色谱法测定人血浆中头孢曲松的含量[J].中国医院药学杂志，2006（03）.
[10]钱生稳，戴红娟，钱春江.注射用唑来膦酸无菌检查法方法学研究CJJ. 海峡药学，2007，19 （7）：46-48.
[11]涂林，余方键，胡昌勤.国产注射用头孢曲松钠的质量现状[J].中国药事，2002（01）.
[12]苏德模，马绪荣，许华玉，等.药品微生物学检验技术[M]北京：华龄出版社，2007：1.
[13]钱之玉.药理学进展.抗菌药物的发展概况[M].东南大学出版社，2005：5.
【关键词】注射用头孢曲松钠；无菌检查；验证
头孢曲松钠属第三代头孢菌素，具广谱抗菌作用，对流感嗜血杆菌、肠杆菌科细菌、淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌有较强抗菌作用，对阴沟肠杆菌、不动杆菌属和铜绿假单胞菌作用较差[1-5]。头孢曲松钠化学名为[6R-[6a，7b（Z）]]-7[[2，3-二氢-2-亚氨基-4-噻唑基）（甲氧亚氨基）乙酰基]氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂二环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸钠盐[6-8]。头孢曲松钠常用于肺炎、烧伤感染、腹膜炎、支气管炎、尿道感染、败血症、脑膜炎、皮肤及伤口的感染、胃肠道感染、肺化脓症、肾脏感染、生殖器感染等[9-10]。无菌检查采用薄膜过滤法是取样量较大的集菌方法，具有代表性，不易漏检等特点[11-13]。本实验对注射用头孢曲松钠无菌检查方法进行验证验证。
1.试验环境与材料
1.1试验环境
在环境洁净度为B+A的无菌室中进行。
1.2仪器
NKF330一次性全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、HTY-601智能集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）、HY-2（A）调速多用振荡器（常州华冠仪器制造有限公司）、SPX-250智能生化培养箱（常州华冠仪器制造有限公司）、MJX-150B智能霉菌培养箱（常州华冠仪器制造有限公司）、YXQ-LS-30SII高压灭菌锅（西安常仪仪器设备有限公司）、FB224电子分析天平（江苏淮安翔宇电子衡器公司）。
1.3试验用菌株
生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）、白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]（第4代）、大肠埃希菌ECMCC（B）44lO23（第3代）、黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）。
1.4培养基、稀释液及缓冲液
1.4.1干粉培养基
硫乙醇酸盐培养基（湖北鑫润德化工有限公司）、改良马丁琼脂培养基（威海新月化玻仪器有限公司）、改良马丁培养基（上海研域生物科技有限公司）、玫瑰红钠琼脂培养基（上海研域生物科技有限公司）、营养琼脂培养基（威海新月化玻仪器有限公司）。
1.4.2细菌稀释液
氯化钠溶液（广州百特医疗用品有限公司）。
1.4.3冲洗用缓冲液
pH 7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液（上海研域生物科技有限公司）。
2.方法与结果
2.1菌液制备
（1）取经30℃～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，备用。
（2）取经30℃～35℃培养18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-7备用。
（3）取经23℃～28℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6，备用。
（4）取经23℃～28℃培养5～7天的黑曲霉斜面培养物，加3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，备用。
2.2菌液计数
每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml，注入约15毫升、45摄氏度改良马丁琼脂平皿，经26摄氏度生化培养箱培养72小时，金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液、大肠埃希菌液各1ml，注入约15 毫升、45摄氏度营养琼脂平皿，经36摄氏度生化培养箱培养48小时，活菌计数。生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）菌落数78cfu/ml，白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）菌落数65cfu/ml，金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）菌落数75cfu/ml，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]（第4代）菌落数，69cfu/ml，大肠埃希菌ECMCC （B）44lO23（第3代）菌落数82cfu/ml，黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）菌落数62cfu/ml。
2.3方法的验证采用薄膜过滤法
2.3.1供试液制备
取供试品15支溶于500ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于七个滤筒中过滤，冲洗液用量为每筒500ml，每次50ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液（约为10～100个/筒），依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基，按规定条件培养14天。逐日观察。
2.3.2对照组
另取7个滤筒，分别加入1ml相应的试验菌，再加入相应等量培养基，作为对照，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.3供试品对照组
取供试品15支，溶于500ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于2个滤筒中过滤，冲洗滤膜数次，每次50ml，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2010年版《中国药典》二部无菌检查法，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.4空白对照组 取试验用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.5阴性对照组
取冲洗用0.1%蛋白胨缓冲液及0.9%的无菌氯化钠溶液适量，分置于两个滤筒中过滤，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.6培养
硫乙醇酸盐流体培养基桶30～35℃培养；真菌培养基桶23～28℃培养，培养 14d。每天观察并记录。
结果表明，头孢曲松钠对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。注射用头孢曲松钠采用薄膜过滤法进行无菌检查时，缓冲液冲洗量以500ml/筒为宜，可以选择大肠埃希菌或金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。
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[1]张昕，黄文静，张肖群.注射用头孢呋辛钠溶液颜色检查不合格测定结果分析[J].今日药学，2010（02）.
[2]李军，黄萍，谢元超，于力，单红宾.用HPLC法测定头孢曲松钠、头孢噻肟钠、头孢哌酮钠聚合物[J].中国药品标准，2002（03）.
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[6]刘浩，仇士林.头孢曲松钠HPLC法含量测定[J].中国抗生素杂志，2002（05）.
[7]李艳枫，王晶.头孢曲松钠生产工艺与色级的关系[J].黑龙江医药，2010（02）.
[8]戎晓娟，肖丹，王炜，张春然，杨红.头孢菌素中间体GCLE的主要相关杂质研究[J].中国抗生素杂志，2009（03）.
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