论文部分内容阅读
摘 要：为拓宽烟草不育基因的来源，依据辣椒雄性不育基因Cams1序列，在烟草品种K326中同源克隆获得基因Ntms1，采用生物信息学方法对辣椒Cams1基因和烟草Ntms1基因的核苷酸序列、蛋白质结构、亲疏水性及结构域等进行分析，并利用CRISPR/Cas9技术对Ntms1基因功能进行了验证。结果表明，Cams1基因和Ntms1基因的蛋白质序列相似度为85.25%，基因编码产物具有相同的PHD功能结构域，都具有磷酸化识别位点，有相似的二级和三级蛋白质结构，且两个基因都没有信号肽和跨膜区的结构，推测烟草Ntms1基因与辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。遗传转化结果表明，突变株的Ntms1基因表达量和有活力花粉量极显著低于野生型植株，证明了烟草Ntms1基因具有控制烟草花粉育性功能。
关键词：烟草;雄性不育;ms1基因;生物信息学;遗传转化
Homologous Cloning and Bioinformatics Analysis of Gene Cams1 in Tobacco
ZHAO Tingting1， CHEN Qian1， XIA Zhilin2， WANG Jun2， YU Qiwei3， WANG Lei1，
NIE Qiong1， LIU Yang1， LIU Renxiang1*
（1. College of Tobacco， Guizhou University， Guizhou Key Laboratory for Tobacco Quality Research， Guiyang 550025， China;
2. Zunyi Tobacco Company， Zunyi， Guizhou 564000， China; 3. Bijie Tobacco Company， Bijie， Guizhou 551700， China）
Abstract： To broaden the source of tobacco sterility genes， based on the capsicum male sterility gene Cams1 sequence， the gene Ntms1 was homologously cloned in tobacco variety K326. Bioinformatics method was employed to analyze the nucleotide sequence， protein structure， hydrophilicity and domain of Capsicum gene Cams1 and tobacco gene Ntms1， and the function of Ntms1 was verified by using CRISPR/Cas9 technique. Results showed that the protein sequence similarity of Cams1 and Ntms1 reached 85.25%， with the products encoded by the two genes having same PHD functional domain， same phosphorylation recognition site， similar secondary and tertiary protein structures， and the two genes had no signal peptide and transmembrane structure. It was speculated that tobacco Ntms1 gene and pepper sterile gene Cams1 had similar function of fertility control. The results of genetic transformation showed that the expression of Ntms1 and the amount of active pollen in the mutant were highly significantly lower than that in the wild type， which proved that Ntms1 had the function of tobacco pollen fertility control.
Keywords： tobacco; male sterility; ms1 gene; bioinformatics; genetic transformation
植物雄性不育（male sterility，MS）是指植物雄性生殖器官發育异常而营养生长及雌性生殖器官发育都正常的现象[1]，在作物育种和分子生物学研究中具有重要作用[2]。利用雄性不育生产杂交种，可省去人工去雄，降低制种成本、提高种子纯度。
烟草生产的收获物是叶片，为了控制品种布局及实现烟叶定位生产，除利用不育杂交种外，往往也将杂交选育的纯系品种转育成不育系在生产上利用。目前，烟叶生产上利用的不育系来源单一，仅有来源于N.suaveolens的胞质不育基因成功利用，导致烟草杂交种和不育系的生产应用存在极大风险，因此，不育性的研究对于烟草极为重要。在烟草雄性不育性的研究中，前人多集中在不育胞质基因的研究上，发现了atp6、atp9、orf25以及orfB等不育胞质基因，而烟草不育核基因研究较少[3]，李胜国等[4]、SCHMULLING等[5]、耿飒等[6]利用转基因技术构建出MS系烟草，但未报道控制烟草育性的细胞核基因;拟南芥[7]、玉米[8]、水稻[9]等作物雄性不育的研究，获得了多个控制作物不育性的核基因。ZOE[7]等发现，拟南芥ms1突变体在早期发育阶段都表现正常，在小孢子释放阶段，小孢子的细胞质和绒毡层开始出现异常液泡化和降解，导致成熟花粉囊中没有活性花粉粒。拟南芥ms1突变体能够导致花粉败育，而对其他器官的生长发育没有不良影响[10]，具有较大的生产应用价值;KYUMI等[11]在辣椒上发现了一个和拟南芥中ms1基因高度同源的雄性不育基因Cams1（登录号CA05g06780）。为了拓宽烟草不育性的来源，本研究通过同源克隆方法，根据辣椒Cams1基因序列，从烟草中同源克隆出Ntms1基因，运用生物信息学和CRISPR/Cas9基因编辑技术对该基因功能进行分析，对于促进烟草雄性不育性的研究及拓宽烟草不育性的来源有较为重要的科学意义和实践价值。 1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料与遗传转化培养基 试验所用烤烟品种K326由贵州省烟草品质研究重点实验室提供。遗传转化所用培养基配方参照文献[13]。
1.1.2 载体与菌株 本试验所采用的大肠杆菌Escherichia coli菌株DH5α，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105均由贵州省烟草品质研究重点实验室保存并提供;克隆载体pMD18-T vetor T由陕西博瑞德生物科技有限公司提供;CRISPR/Cas9重组载体MSG2靶点设计与比对在贵州省烟草品质研究重点实验室完成，CRISPR/Cas9重组载体合成由百格基因科技（江蘇）有限公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 采用RNAiso Plus Tri Zol（Ta Ka Ra）提取总RNA。采用Poly A Ttract? mRNA Isolation System Ⅲ with Magnetic Stand（Promega）试剂盒合成cDNA，购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2.2 普通烟草Ntms1的PCR扩增及克隆 从NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得辣椒ms1蛋白的氨基酸序列Cams1，用此氨基酸序列与普通烟草进行比对，找到与之同源性较高的类ms1蛋白，以其氨基酸序列获得烟草中ms1基因的序列（GenBank登录号为LOC107813657），用此序列在Primer6.0软件中设计特异性引物657-F（ATGGTGGTAATGAATGGAAGGCC）/657-R（TCA
GGCAGCATTAGTCAAGC），以普通烟草K326品种的叶片cDNA为模板，扩增LOC107813657基因的CDS序列，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带连接到T载体，送往陕西博瑞德生物科技有限公司测序，并将序列命名为Ntms1。
1.2.3 生物信息学分析 利用NCBI中的ORF （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）确定辣椒Cams1及烟草Ntms1基因编码蛋白质的开放阅读框;ProtParam系统（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质等电点（PI）、消光系数及不稳定系数等理化性质;Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）预测蛋白质的亲疏水性;Inter-Pro（http：//www.ebi. ac.uk/interpro/）分析蛋白质结构域;NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白质磷酸化位点;SOPMA分析和预测蛋白质的二级结构;Phyre2分析预测蛋白质的三级结构;TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白质的跨膜结构域。Signal P4.1 分析蛋白质是否含有信号肽;DNAMAN 软件对蛋白质序列进行相似性比对;MEGA7.0 软件构建分子进化树。
1.2.4 烟草Ntms1的功能验证 （1）遗传转化：采用农杆菌介导[14]的烟草叶片遗传转化法。
（2）阳性植株筛选：以提取转化植株DNA为模板，用Cas9载体序列特异引物Cas9-F（CACCAT CTACCACCTGAGAA）/Cas9-R（CGAAGTTGCTCT TGAAGTT）及潮霉素抗性基因特异引物HYG-F（CTCGTGCTTTCAGCTTCGATGT）/HYG-R（TGT CGTCCATCACAGTTTGCCA），对转化植株进行筛选。
（3）阳性植株基因测序：设计引物Ntms1-1F（TCCTACAAATAGGCTCCGAGA）/Ntms1-1R（TGCACGATTTGCACCTAGAC），以转化阳性单株DNA为模板扩增靶位点序列，对PCR产物进行测序。
（4）突变植株Ntms1基因表达量分析：以反转录的cDNA为模板，根据Ntms1序列设计荧光定量PCR引物PHD_F（ATGTTGGCTTGTGATGT CTG）/ PHD_R（TTCCCGCTTGTATTTGTAGTC），以烟草Actin内参基因引物Actin-F（CATGAAGATTAA
AGGCGGAGTG）/Actin-R（AACAGTTTGGTTGGA GTTCTGG）进行Ntms1基因表达量分析。
（5）突变植株花粉活力鉴定：盛花期时取即将成熟开裂的花药，解剖针去除花药壁，挑出全部花粉，经200 ?L碘钾（I-KI）染色液染色混匀后，在显微镜（40×）下观察花粉形态及染色情况，每株植株随机选取5个视野，计算染色花粉数量。
2 结 果
2.1 目的基因的扩增及克隆
单菌落PCR方法阳性克隆鉴定结果（图1）显示，有与目的基因条带大小一致的条带，说明克隆成功。
2.2 烟草Ntms1生物信息学分析
2.2.1 开放阅读框分析 对基因的开放阅读框进行定位，辣椒Cams1起始密码子位于第1个核苷酸，终止密码子位于第2100个核苷酸，共编码699个氨基酸;烟草Ntms1起始密码子位于第36个核苷酸，终止密码子位于第2174个核苷酸，共编码712个氨基酸;两个基因编码区相互重叠，编码氨基酸数量相差极小，说明两个基因编码的蛋白质差异不大。 2.2.2 理化性质分析 从理化分析结果（表1）看出，两个基因各理化性质指标都极为接近。
2.2.3 蛋白比对 相似性比对结果得出Cams1基因和Ntms1基因编码的蛋白质相似度为85.25%，氨基酸序列有较高的相似度（图2）。
2.2.4 亲疏水性分析 亲疏水性（图3）分析初步认为两种蛋白质均具有较强的亲水性。
2.2.5 功能结构域分析 结构域分析结果所示，Cams1、Ntms1基因编码产物都具有相同的PHD结构域。
2.2.6 二级结构及三级结构预测 对蛋白质的二级结构（表2）和三级结构分析，结果可以看出二者空间结构相似度很高。
2.2.7 磷酸化位点分析 磷酸化位点分析结果显示，Cams1、Ntms1都是具有蛋白激酶活性的受体。
2.2.8 信号肽及跨膜区分析 信号肽分析预测显示，Cams1、Ntms1蛋白都无信号肽序列特征，由此预测两者均为非分泌蛋白。进一步对跨膜区域进行预测发现，Cams1、Ntms1蛋白都不存在跨膜区，均为非跨膜蛋白。
2.2.9 系统进化树分析 在NCBI网站上选取具有雄性不育功能的物种进行进化树分析，结果所示（图4），Cams1、Ntms1亲缘关系比较近。
经过生物信息学初步分析，Cams1、Ntms1二者基因结构及编码的蛋白质性质差异极小，可以初步推测烟草Ntms1可能与辣椒Cams1具有相同的控制育性的功能。
2.3 烟草Ntms1基因突变效应分析
2.3.1 阳性植株筛选 对转化植株进行Cas9基因及HYG潮霉素基因进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，均扩增出与预期产物大小相同的目的条带（图5），说明Cas9基因已经进入植株体内。
2.3.2 阳性植株目的基因测序 对获得的转化阳性植株用靶点检测引物对靶点上下游区域进行PCR 扩增，并将扩增产物进行测序分析，结果表明，6株阳性植株均发生了编辑（图6）。
2.3.3 突变植株基因表达分析 RNA质量检测结果显示（图7），将其逆转录为cDNA，并分别用烟草内参基因和Ntms1基因荧光定量引物对所得cDNA进行PCR检测，条带指示的大小与预期大小一致。
对6株突变植株进行基因表达量分析，结果如图8所示，6株突变株的Ntms1基因表达量较野生型均发生不同程度的降低，统计分析结果显示，与野生型植株相比，突变株目的基因相对表达量均达到了极显著差异，进一步说明CRISPR/Cas9载体在烟草植株体内对目的基因发挥了作用，导致目的基因在表达水平上发生改变，产生了突变效应。
2.3.4 突变植株花粉活力鉴定 有活力花粉数量和花粉活力是鉴定育性最直接的指标，突变植株花粉数量和花粉活力鉴定结果显示（表3，图9），每视野下突变株花药中有活力花粉数量极显著低于野生型，说明Ntms1基因具有控制烟草育性的作用;由图9看出，突变株花粉粒染色后颜色均呈淡黄色，较野生型花粉粒颜色浅，表明突变株中有活力花粉粒的数量较野生型低。
3 讨 论
杂种优势是生物界的一种普遍现象，也是提高作物产量和品质的重要育种途径，水稻和玉米杂交种的大面积利用对我国乃至世界粮食增产和安全作出了巨大贡献[16]。生产上要使用杂交种，就必须年年制种，制种过程中人工去雄不仅浪费人力，且容易因去雄不彻底导致种子不纯，影响生产[15]。利用雄性不育系制种，可以省去人工去雄环节，既降低种子生产成本，又提高制种质量，因此，不育系的选育对作物杂种优势研究利用极为重要。
利用生物信息学方法对基因序列进行分析，可以发掘基因信息，预测基因的生物学功能，提高基因功能鉴定的效率[16]。在烟草基因组中，生物信息学分析能够进行遗传图谱构建、转录数据分析等[17]。周辉[18]等利用生物信息学方法分析了大肠杆菌HspQ基因;张长静[20]等运用生物信息学方法分析了烟草雄性不育系及保持系的sdh3、sdh4基因在其核苷酸、编码蛋白各结构层次上存在的差异。辣椒与烟草同为茄科作物，基因可能具有一定的相似性，本研究通过生物信息学方法对Ntms1基因编码蛋白质序列的理化性质、信号肽、跨膜结构域、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行预测分析，其结果为研究Ntms1基因及其编码产物的结构和功能提供了更多的信息。
基因编辑技术是一种能精确修饰生物体基因组特定目标基因的一种基因工程技术，其中基因敲除是鉴定基因功能最直接的方法[20-21]。常爱霞等[22]通過构建重组载体转化烟草得到早花植株;在对Cams1基因的研究中，KYUMI等[12]表明，Cams1基因具有控制花粉育性的功能，具体表现为与可育植株相比，不育辣椒植株花粉量明显降低;而在对辣椒核不育基因的研究中，DASKALOFF等[23]也发现了不育植株中花粉败育的现象。本研究构建ms1基因敲除载体后进行遗传转化，阳性植株的基因表达量及有活力花粉数均极显著低于野生型植株，与前人在辣椒上的研究结果一致，进一步说明烟草上ms1基因同样具有控制育性的功能。通过进一步对本研究获得的部分不育植株的自交筛选，育成烟草新不育系，可能对拓宽烟草制种的不育性来源有非常重要的实践意义。
4 结 论
本研究采用生物信息学分析方法，以辣椒不育基因Cams1为模板，在烟草品种K326中克隆出序列Ntms1，结果表明Cams1和Ntms1基因编码产物具有相似的结构，由此预测Ntms1与辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。通过基因编辑技术，以农杆菌介导的方法将辣椒ms1基因转入烤烟品种K326后获得了6株阳性突变植株。与野生型对照植株比较，突变株ms1基因表达量极显著降低，有活力花粉数极显著低于野生型植株，最终获得了部分不育植株，对于促进烟草雄性不育性的研究有较为重要的科学意义和实践价值。 参考文献
[1]杨莉芳，刁现民. 植物细胞核雄性不育基因研究进展[J]. 植物遗传资源学报，2013，14（6）：1108-1117.
YANG L F， DIAO X M. Progress in identification of plant male sterility related nuclear genes[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2013， 14（6）： 1108-1117.
[2]付伟，马小军，唐其，等. 我国植物细胞核雄性不育基因研究进展[J]. 安徽农业科学，2010，38（17）：8851-8853，8858.
FU W， MA X J， TANG Q， et al. Research progress on genic male sterility of plants in China [J]. Anhui Agricultural Science， 2010， 38 （17）： 8851-8853， 8858.
[3]李凤霞. 烟草重要基因篇：9.烟草雄性不育和育性恢复基因[J]. 中国烟草科学，2015，36（3）：106-108.
LI F X. Important genes of tobacco： 9. Male sterility and fertility restoration genes of tobacco [J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36 （3）： 106-108.
[4]李胜国，刘玉乐，朱锋，等. 基因工程雄性不育烟草的获得[J]. 植物学报，1995（8）：659-660.
LI S G， LIU Y L， ZHU F， et al. Male sterile tobacco plants obtained by genetical engineering [J]. Acta Botanica Sinica， 1995 （8）： 659-660.
[5]SCHMüLLING T， SCHELL J， SPENA A. Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development[J]. The Embo Journal， 1988（7）： 2621-2629.
[6]耿飒，麻密，李国凤，等. ipt基因定位表达对转基因烟草育性的影响[J]. 植物学报，2000（2）：217-220.
GENG S， MA M， LI G F， et al. Effects on fertility in transgenic tobacco by localized expression of ipt gene[J]. Acta Botanica Sinica， 2000（2）： 217-220.
[7]ZOE A W， SHAUN M M， JANET D， et al. The Arabidopsis male sterility1 （MS1） gene is a transcriptional regulator of male gametogenesis， with homology to the PHD-finger family of transcription factors[J]. Plant Cell J， 2001， 28（1）： 27-39.
[8]吕庆雪，高嵩，孙蕾，等. 玉米雄性不育基因Zmms1的同源克隆及生物信息学分析[J]. 玉米科学，2018，26（2）：44-52.
LYU Q X， GAO S， SUN L， et al. Bioinformatics analysis of male sterile gene ms1 homologs in Maize [J]. Maize Science， 2018， 26（2）： 44-52.
[9]轩丹丹. 两个水稻细胞核雄性不育基因的图位克隆[D]. 北京：中国农业科学院，2017.
XUAN D D. Map-based cloning of two genic male sterility genes in rice [D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2017.
[10]KAZUO S. Arabidopsis male sterility1 encodes a PHD-Typetranscription factor and gulates pollen and tapetum development[J]. Plant Cell J， 2007， 19： 3549-3562.
[11]劉振林，柯丽萍，何海燕，等.甘蓝型油菜雄性不育基因BnaX.MS1.a的克隆及其amiRNA载体的构建[J]. 浙江农业学报，2010，22（5）：552-557.
LIU Z L， KE L P， HE H Y， et al. Molecular cloning of male sterile gene BnaX. MS1. a in Brassica napus and construction of a vector with MS1 amiRNA[J]. Journal of Zhejiang Agriculture， 2010， 22 （5）： 552-557.
[12]KYUMI J， DOIL C， JUNDAE L. Fine mapping of the genic male-sterile ms1 gene in Capsicum annuum L.[J]. Theor Appl Genet， 2018， 131： 183-191. [13]田茂竹. 應用CRISPR/Cas9技术定向突变烟草CYP71D16基因的研究[D]. 贵阳：贵州大学，2019.
TIAN M Z. Study on the gene of CYP71D16 directed mutation by CRISPR/Cas9 technology in tobacco[D]. Guiyang： Guizhou University， 2019.
[14]HORSCH R B， FRY J， HOFFMANN N， et al. Leaf disc transformation[M]//GELVIN S B， SCHILPEROORT R A， VERMA D P S. Plant Molecular Biology Manual， Dordrecht： Springer， 1989： 63-71.
[15]周东洁，王国平，索文龙，等. 烟草雄性不育系与其同型可育品种雌蕊性状比较[J]. 种子，2018，37（3）：71-75.
ZHOU D J， WANG G P， SUO W L et al. Comparison of the pistil character of the male sterile lines and the same type of conventional variety of tobacco [J]. Seed， 2018， 37 （3）： 71-75.
[16]WEI G， TAO Y， LIU G， et al. A transcriptomic analysis of super hybrid rice LYP9 and its parents Proc[J]. Natl Acad Sci， 2009， 106（19）： 7695-7701.
[17]龚达平. 烟草基因组学研究方法篇：6.生物信息学在烟草基因组研究中的应用[J]. 中国烟草科学，2011，32（6）：94-95.
GONG D P. Research methods of tobacco genomics： 6. Application of bioinformatics in tobacco genomics [J]. Chinese Tobacco Science， 2011， 32（6）： 94-95.
[18]周辉，宋莉，赵德刚. 大肠杆菌HspQ基因的生物信息学分析[J]. 山地农业生物学报，2018，37（5）：57-61.
ZHOU H， SONG L， ZHAO D G. Bioinformatics analysis of HspQ gene in Escherichia coli[J]. Journal of Mountain Agricultural Biology， 2018， 37 （5）： 57-61.
[19]张长静，李凤霞，贾兴华，等. 烟草细胞质雄性不育线粒体基因sdh3和sdh4的生物信息学分析[J]. 中国烟草科学，2013，34（3）：42-47.
ZHANG C J， LI F X， JIA X H， et al. Bioinformatics analysis of mitochondrial genes sdh3 and sdh4 in cytoplasmic male sterility of tobacco [J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34 （3）： 42-47.
[20]KIM Y A， MOON H， PARK C J. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of Os8N3 in rice to confer resistance to Xanthomonas oryzae， pv. oryzae[J]. Rice， 2019， 12（1）： 67.
[21]SHI J， GAO H， WANG H， et al. ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions[J]. Plant Biotechnology Journal， 2017， 15（2）： 207-216.
[22]常爱霞，郭利杰，刘旦，等. 拟南芥花期基因转化烟草及其早花反应特性研究[J]. 中国烟草科学，2016，37（1）：1-7.
CHANG A X， GUO L J， LIU D， et al. Study on the response characteristics of Arabidopsis early flowering transgenic tobacco [J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37 （1）： 1-7.
[23]DASKALOFF S. Two new male sterile pepper （Capsicum annuum L） mutants[J]. Akad Selskostop Nauki Dokl C R， 1971， 4： 291-294.
基金项目：贵州省高层次创新型人才培养计划——百层次人才{黔科合平台人才[2016]5663号};贵州省烟草公司重大专项“优质烤烟品种选育关键技术研究与品种选育”（黔烟科201602）;贵州省烟草公司遵义市公司项目“遵义烟区烤烟品种筛选布局与后备品种选育研究”{遵烟计[2016]07号}
作者简介：赵婷婷（1996-），女，在读硕士研究生，研究方向：作物遗传育种。E-mail：ttzhao5153@qq.com。*通信作者，E-mail：rxliu@gzu.edu.cn
收稿日期：2019-09-06 修回日期：2019-12-16
关键词：烟草;雄性不育;ms1基因;生物信息学;遗传转化
Homologous Cloning and Bioinformatics Analysis of Gene Cams1 in Tobacco
ZHAO Tingting1， CHEN Qian1， XIA Zhilin2， WANG Jun2， YU Qiwei3， WANG Lei1，
NIE Qiong1， LIU Yang1， LIU Renxiang1*
（1. College of Tobacco， Guizhou University， Guizhou Key Laboratory for Tobacco Quality Research， Guiyang 550025， China;
2. Zunyi Tobacco Company， Zunyi， Guizhou 564000， China; 3. Bijie Tobacco Company， Bijie， Guizhou 551700， China）
Abstract： To broaden the source of tobacco sterility genes， based on the capsicum male sterility gene Cams1 sequence， the gene Ntms1 was homologously cloned in tobacco variety K326. Bioinformatics method was employed to analyze the nucleotide sequence， protein structure， hydrophilicity and domain of Capsicum gene Cams1 and tobacco gene Ntms1， and the function of Ntms1 was verified by using CRISPR/Cas9 technique. Results showed that the protein sequence similarity of Cams1 and Ntms1 reached 85.25%， with the products encoded by the two genes having same PHD functional domain， same phosphorylation recognition site， similar secondary and tertiary protein structures， and the two genes had no signal peptide and transmembrane structure. It was speculated that tobacco Ntms1 gene and pepper sterile gene Cams1 had similar function of fertility control. The results of genetic transformation showed that the expression of Ntms1 and the amount of active pollen in the mutant were highly significantly lower than that in the wild type， which proved that Ntms1 had the function of tobacco pollen fertility control.
Keywords： tobacco; male sterility; ms1 gene; bioinformatics; genetic transformation
植物雄性不育（male sterility，MS）是指植物雄性生殖器官發育异常而营养生长及雌性生殖器官发育都正常的现象[1]，在作物育种和分子生物学研究中具有重要作用[2]。利用雄性不育生产杂交种，可省去人工去雄，降低制种成本、提高种子纯度。
烟草生产的收获物是叶片，为了控制品种布局及实现烟叶定位生产，除利用不育杂交种外，往往也将杂交选育的纯系品种转育成不育系在生产上利用。目前，烟叶生产上利用的不育系来源单一，仅有来源于N.suaveolens的胞质不育基因成功利用，导致烟草杂交种和不育系的生产应用存在极大风险，因此，不育性的研究对于烟草极为重要。在烟草雄性不育性的研究中，前人多集中在不育胞质基因的研究上，发现了atp6、atp9、orf25以及orfB等不育胞质基因，而烟草不育核基因研究较少[3]，李胜国等[4]、SCHMULLING等[5]、耿飒等[6]利用转基因技术构建出MS系烟草，但未报道控制烟草育性的细胞核基因;拟南芥[7]、玉米[8]、水稻[9]等作物雄性不育的研究，获得了多个控制作物不育性的核基因。ZOE[7]等发现，拟南芥ms1突变体在早期发育阶段都表现正常，在小孢子释放阶段，小孢子的细胞质和绒毡层开始出现异常液泡化和降解，导致成熟花粉囊中没有活性花粉粒。拟南芥ms1突变体能够导致花粉败育，而对其他器官的生长发育没有不良影响[10]，具有较大的生产应用价值;KYUMI等[11]在辣椒上发现了一个和拟南芥中ms1基因高度同源的雄性不育基因Cams1（登录号CA05g06780）。为了拓宽烟草不育性的来源，本研究通过同源克隆方法，根据辣椒Cams1基因序列，从烟草中同源克隆出Ntms1基因，运用生物信息学和CRISPR/Cas9基因编辑技术对该基因功能进行分析，对于促进烟草雄性不育性的研究及拓宽烟草不育性的来源有较为重要的科学意义和实践价值。 1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料与遗传转化培养基 试验所用烤烟品种K326由贵州省烟草品质研究重点实验室提供。遗传转化所用培养基配方参照文献[13]。
1.1.2 载体与菌株 本试验所采用的大肠杆菌Escherichia coli菌株DH5α，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105均由贵州省烟草品质研究重点实验室保存并提供;克隆载体pMD18-T vetor T由陕西博瑞德生物科技有限公司提供;CRISPR/Cas9重组载体MSG2靶点设计与比对在贵州省烟草品质研究重点实验室完成，CRISPR/Cas9重组载体合成由百格基因科技（江蘇）有限公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 采用RNAiso Plus Tri Zol（Ta Ka Ra）提取总RNA。采用Poly A Ttract? mRNA Isolation System Ⅲ with Magnetic Stand（Promega）试剂盒合成cDNA，购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2.2 普通烟草Ntms1的PCR扩增及克隆 从NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得辣椒ms1蛋白的氨基酸序列Cams1，用此氨基酸序列与普通烟草进行比对，找到与之同源性较高的类ms1蛋白，以其氨基酸序列获得烟草中ms1基因的序列（GenBank登录号为LOC107813657），用此序列在Primer6.0软件中设计特异性引物657-F（ATGGTGGTAATGAATGGAAGGCC）/657-R（TCA
GGCAGCATTAGTCAAGC），以普通烟草K326品种的叶片cDNA为模板，扩增LOC107813657基因的CDS序列，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带连接到T载体，送往陕西博瑞德生物科技有限公司测序，并将序列命名为Ntms1。
1.2.3 生物信息学分析 利用NCBI中的ORF （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）确定辣椒Cams1及烟草Ntms1基因编码蛋白质的开放阅读框;ProtParam系统（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质等电点（PI）、消光系数及不稳定系数等理化性质;Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）预测蛋白质的亲疏水性;Inter-Pro（http：//www.ebi. ac.uk/interpro/）分析蛋白质结构域;NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白质磷酸化位点;SOPMA分析和预测蛋白质的二级结构;Phyre2分析预测蛋白质的三级结构;TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白质的跨膜结构域。Signal P4.1 分析蛋白质是否含有信号肽;DNAMAN 软件对蛋白质序列进行相似性比对;MEGA7.0 软件构建分子进化树。
1.2.4 烟草Ntms1的功能验证 （1）遗传转化：采用农杆菌介导[14]的烟草叶片遗传转化法。
（2）阳性植株筛选：以提取转化植株DNA为模板，用Cas9载体序列特异引物Cas9-F（CACCAT CTACCACCTGAGAA）/Cas9-R（CGAAGTTGCTCT TGAAGTT）及潮霉素抗性基因特异引物HYG-F（CTCGTGCTTTCAGCTTCGATGT）/HYG-R（TGT CGTCCATCACAGTTTGCCA），对转化植株进行筛选。
（3）阳性植株基因测序：设计引物Ntms1-1F（TCCTACAAATAGGCTCCGAGA）/Ntms1-1R（TGCACGATTTGCACCTAGAC），以转化阳性单株DNA为模板扩增靶位点序列，对PCR产物进行测序。
（4）突变植株Ntms1基因表达量分析：以反转录的cDNA为模板，根据Ntms1序列设计荧光定量PCR引物PHD_F（ATGTTGGCTTGTGATGT CTG）/ PHD_R（TTCCCGCTTGTATTTGTAGTC），以烟草Actin内参基因引物Actin-F（CATGAAGATTAA
AGGCGGAGTG）/Actin-R（AACAGTTTGGTTGGA GTTCTGG）进行Ntms1基因表达量分析。
（5）突变植株花粉活力鉴定：盛花期时取即将成熟开裂的花药，解剖针去除花药壁，挑出全部花粉，经200 ?L碘钾（I-KI）染色液染色混匀后，在显微镜（40×）下观察花粉形态及染色情况，每株植株随机选取5个视野，计算染色花粉数量。
2 结 果
2.1 目的基因的扩增及克隆
单菌落PCR方法阳性克隆鉴定结果（图1）显示，有与目的基因条带大小一致的条带，说明克隆成功。
2.2 烟草Ntms1生物信息学分析
2.2.1 开放阅读框分析 对基因的开放阅读框进行定位，辣椒Cams1起始密码子位于第1个核苷酸，终止密码子位于第2100个核苷酸，共编码699个氨基酸;烟草Ntms1起始密码子位于第36个核苷酸，终止密码子位于第2174个核苷酸，共编码712个氨基酸;两个基因编码区相互重叠，编码氨基酸数量相差极小，说明两个基因编码的蛋白质差异不大。 2.2.2 理化性质分析 从理化分析结果（表1）看出，两个基因各理化性质指标都极为接近。
2.2.3 蛋白比对 相似性比对结果得出Cams1基因和Ntms1基因编码的蛋白质相似度为85.25%，氨基酸序列有较高的相似度（图2）。
2.2.4 亲疏水性分析 亲疏水性（图3）分析初步认为两种蛋白质均具有较强的亲水性。
2.2.5 功能结构域分析 结构域分析结果所示，Cams1、Ntms1基因编码产物都具有相同的PHD结构域。
2.2.6 二级结构及三级结构预测 对蛋白质的二级结构（表2）和三级结构分析，结果可以看出二者空间结构相似度很高。
2.2.7 磷酸化位点分析 磷酸化位点分析结果显示，Cams1、Ntms1都是具有蛋白激酶活性的受体。
2.2.8 信号肽及跨膜区分析 信号肽分析预测显示，Cams1、Ntms1蛋白都无信号肽序列特征，由此预测两者均为非分泌蛋白。进一步对跨膜区域进行预测发现，Cams1、Ntms1蛋白都不存在跨膜区，均为非跨膜蛋白。
2.2.9 系统进化树分析 在NCBI网站上选取具有雄性不育功能的物种进行进化树分析，结果所示（图4），Cams1、Ntms1亲缘关系比较近。
经过生物信息学初步分析，Cams1、Ntms1二者基因结构及编码的蛋白质性质差异极小，可以初步推测烟草Ntms1可能与辣椒Cams1具有相同的控制育性的功能。
2.3 烟草Ntms1基因突变效应分析
2.3.1 阳性植株筛选 对转化植株进行Cas9基因及HYG潮霉素基因进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，均扩增出与预期产物大小相同的目的条带（图5），说明Cas9基因已经进入植株体内。
2.3.2 阳性植株目的基因测序 对获得的转化阳性植株用靶点检测引物对靶点上下游区域进行PCR 扩增，并将扩增产物进行测序分析，结果表明，6株阳性植株均发生了编辑（图6）。
2.3.3 突变植株基因表达分析 RNA质量检测结果显示（图7），将其逆转录为cDNA，并分别用烟草内参基因和Ntms1基因荧光定量引物对所得cDNA进行PCR检测，条带指示的大小与预期大小一致。
对6株突变植株进行基因表达量分析，结果如图8所示，6株突变株的Ntms1基因表达量较野生型均发生不同程度的降低，统计分析结果显示，与野生型植株相比，突变株目的基因相对表达量均达到了极显著差异，进一步说明CRISPR/Cas9载体在烟草植株体内对目的基因发挥了作用，导致目的基因在表达水平上发生改变，产生了突变效应。
2.3.4 突变植株花粉活力鉴定 有活力花粉数量和花粉活力是鉴定育性最直接的指标，突变植株花粉数量和花粉活力鉴定结果显示（表3，图9），每视野下突变株花药中有活力花粉数量极显著低于野生型，说明Ntms1基因具有控制烟草育性的作用;由图9看出，突变株花粉粒染色后颜色均呈淡黄色，较野生型花粉粒颜色浅，表明突变株中有活力花粉粒的数量较野生型低。
3 讨 论
杂种优势是生物界的一种普遍现象，也是提高作物产量和品质的重要育种途径，水稻和玉米杂交种的大面积利用对我国乃至世界粮食增产和安全作出了巨大贡献[16]。生产上要使用杂交种，就必须年年制种，制种过程中人工去雄不仅浪费人力，且容易因去雄不彻底导致种子不纯，影响生产[15]。利用雄性不育系制种，可以省去人工去雄环节，既降低种子生产成本，又提高制种质量，因此，不育系的选育对作物杂种优势研究利用极为重要。
利用生物信息学方法对基因序列进行分析，可以发掘基因信息，预测基因的生物学功能，提高基因功能鉴定的效率[16]。在烟草基因组中，生物信息学分析能够进行遗传图谱构建、转录数据分析等[17]。周辉[18]等利用生物信息学方法分析了大肠杆菌HspQ基因;张长静[20]等运用生物信息学方法分析了烟草雄性不育系及保持系的sdh3、sdh4基因在其核苷酸、编码蛋白各结构层次上存在的差异。辣椒与烟草同为茄科作物，基因可能具有一定的相似性，本研究通过生物信息学方法对Ntms1基因编码蛋白质序列的理化性质、信号肽、跨膜结构域、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行预测分析，其结果为研究Ntms1基因及其编码产物的结构和功能提供了更多的信息。
基因编辑技术是一种能精确修饰生物体基因组特定目标基因的一种基因工程技术，其中基因敲除是鉴定基因功能最直接的方法[20-21]。常爱霞等[22]通過构建重组载体转化烟草得到早花植株;在对Cams1基因的研究中，KYUMI等[12]表明，Cams1基因具有控制花粉育性的功能，具体表现为与可育植株相比，不育辣椒植株花粉量明显降低;而在对辣椒核不育基因的研究中，DASKALOFF等[23]也发现了不育植株中花粉败育的现象。本研究构建ms1基因敲除载体后进行遗传转化，阳性植株的基因表达量及有活力花粉数均极显著低于野生型植株，与前人在辣椒上的研究结果一致，进一步说明烟草上ms1基因同样具有控制育性的功能。通过进一步对本研究获得的部分不育植株的自交筛选，育成烟草新不育系，可能对拓宽烟草制种的不育性来源有非常重要的实践意义。
4 结 论
本研究采用生物信息学分析方法，以辣椒不育基因Cams1为模板，在烟草品种K326中克隆出序列Ntms1，结果表明Cams1和Ntms1基因编码产物具有相似的结构，由此预测Ntms1与辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。通过基因编辑技术，以农杆菌介导的方法将辣椒ms1基因转入烤烟品种K326后获得了6株阳性突变植株。与野生型对照植株比较，突变株ms1基因表达量极显著降低，有活力花粉数极显著低于野生型植株，最终获得了部分不育植株，对于促进烟草雄性不育性的研究有较为重要的科学意义和实践价值。 参考文献
[1]杨莉芳，刁现民. 植物细胞核雄性不育基因研究进展[J]. 植物遗传资源学报，2013，14（6）：1108-1117.
YANG L F， DIAO X M. Progress in identification of plant male sterility related nuclear genes[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2013， 14（6）： 1108-1117.
[2]付伟，马小军，唐其，等. 我国植物细胞核雄性不育基因研究进展[J]. 安徽农业科学，2010，38（17）：8851-8853，8858.
FU W， MA X J， TANG Q， et al. Research progress on genic male sterility of plants in China [J]. Anhui Agricultural Science， 2010， 38 （17）： 8851-8853， 8858.
[3]李凤霞. 烟草重要基因篇：9.烟草雄性不育和育性恢复基因[J]. 中国烟草科学，2015，36（3）：106-108.
LI F X. Important genes of tobacco： 9. Male sterility and fertility restoration genes of tobacco [J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36 （3）： 106-108.
[4]李胜国，刘玉乐，朱锋，等. 基因工程雄性不育烟草的获得[J]. 植物学报，1995（8）：659-660.
LI S G， LIU Y L， ZHU F， et al. Male sterile tobacco plants obtained by genetical engineering [J]. Acta Botanica Sinica， 1995 （8）： 659-660.
[5]SCHMüLLING T， SCHELL J， SPENA A. Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development[J]. The Embo Journal， 1988（7）： 2621-2629.
[6]耿飒，麻密，李国凤，等. ipt基因定位表达对转基因烟草育性的影响[J]. 植物学报，2000（2）：217-220.
GENG S， MA M， LI G F， et al. Effects on fertility in transgenic tobacco by localized expression of ipt gene[J]. Acta Botanica Sinica， 2000（2）： 217-220.
[7]ZOE A W， SHAUN M M， JANET D， et al. The Arabidopsis male sterility1 （MS1） gene is a transcriptional regulator of male gametogenesis， with homology to the PHD-finger family of transcription factors[J]. Plant Cell J， 2001， 28（1）： 27-39.
[8]吕庆雪，高嵩，孙蕾，等. 玉米雄性不育基因Zmms1的同源克隆及生物信息学分析[J]. 玉米科学，2018，26（2）：44-52.
LYU Q X， GAO S， SUN L， et al. Bioinformatics analysis of male sterile gene ms1 homologs in Maize [J]. Maize Science， 2018， 26（2）： 44-52.
[9]轩丹丹. 两个水稻细胞核雄性不育基因的图位克隆[D]. 北京：中国农业科学院，2017.
XUAN D D. Map-based cloning of two genic male sterility genes in rice [D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2017.
[10]KAZUO S. Arabidopsis male sterility1 encodes a PHD-Typetranscription factor and gulates pollen and tapetum development[J]. Plant Cell J， 2007， 19： 3549-3562.
[11]劉振林，柯丽萍，何海燕，等.甘蓝型油菜雄性不育基因BnaX.MS1.a的克隆及其amiRNA载体的构建[J]. 浙江农业学报，2010，22（5）：552-557.
LIU Z L， KE L P， HE H Y， et al. Molecular cloning of male sterile gene BnaX. MS1. a in Brassica napus and construction of a vector with MS1 amiRNA[J]. Journal of Zhejiang Agriculture， 2010， 22 （5）： 552-557.
[12]KYUMI J， DOIL C， JUNDAE L. Fine mapping of the genic male-sterile ms1 gene in Capsicum annuum L.[J]. Theor Appl Genet， 2018， 131： 183-191. [13]田茂竹. 應用CRISPR/Cas9技术定向突变烟草CYP71D16基因的研究[D]. 贵阳：贵州大学，2019.
TIAN M Z. Study on the gene of CYP71D16 directed mutation by CRISPR/Cas9 technology in tobacco[D]. Guiyang： Guizhou University， 2019.
[14]HORSCH R B， FRY J， HOFFMANN N， et al. Leaf disc transformation[M]//GELVIN S B， SCHILPEROORT R A， VERMA D P S. Plant Molecular Biology Manual， Dordrecht： Springer， 1989： 63-71.
[15]周东洁，王国平，索文龙，等. 烟草雄性不育系与其同型可育品种雌蕊性状比较[J]. 种子，2018，37（3）：71-75.
ZHOU D J， WANG G P， SUO W L et al. Comparison of the pistil character of the male sterile lines and the same type of conventional variety of tobacco [J]. Seed， 2018， 37 （3）： 71-75.
[16]WEI G， TAO Y， LIU G， et al. A transcriptomic analysis of super hybrid rice LYP9 and its parents Proc[J]. Natl Acad Sci， 2009， 106（19）： 7695-7701.
[17]龚达平. 烟草基因组学研究方法篇：6.生物信息学在烟草基因组研究中的应用[J]. 中国烟草科学，2011，32（6）：94-95.
GONG D P. Research methods of tobacco genomics： 6. Application of bioinformatics in tobacco genomics [J]. Chinese Tobacco Science， 2011， 32（6）： 94-95.
[18]周辉，宋莉，赵德刚. 大肠杆菌HspQ基因的生物信息学分析[J]. 山地农业生物学报，2018，37（5）：57-61.
ZHOU H， SONG L， ZHAO D G. Bioinformatics analysis of HspQ gene in Escherichia coli[J]. Journal of Mountain Agricultural Biology， 2018， 37 （5）： 57-61.
[19]张长静，李凤霞，贾兴华，等. 烟草细胞质雄性不育线粒体基因sdh3和sdh4的生物信息学分析[J]. 中国烟草科学，2013，34（3）：42-47.
ZHANG C J， LI F X， JIA X H， et al. Bioinformatics analysis of mitochondrial genes sdh3 and sdh4 in cytoplasmic male sterility of tobacco [J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34 （3）： 42-47.
[20]KIM Y A， MOON H， PARK C J. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of Os8N3 in rice to confer resistance to Xanthomonas oryzae， pv. oryzae[J]. Rice， 2019， 12（1）： 67.
[21]SHI J， GAO H， WANG H， et al. ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions[J]. Plant Biotechnology Journal， 2017， 15（2）： 207-216.
[22]常爱霞，郭利杰，刘旦，等. 拟南芥花期基因转化烟草及其早花反应特性研究[J]. 中国烟草科学，2016，37（1）：1-7.
CHANG A X， GUO L J， LIU D， et al. Study on the response characteristics of Arabidopsis early flowering transgenic tobacco [J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37 （1）： 1-7.
[23]DASKALOFF S. Two new male sterile pepper （Capsicum annuum L） mutants[J]. Akad Selskostop Nauki Dokl C R， 1971， 4： 291-294.
基金项目：贵州省高层次创新型人才培养计划——百层次人才{黔科合平台人才[2016]5663号};贵州省烟草公司重大专项“优质烤烟品种选育关键技术研究与品种选育”（黔烟科201602）;贵州省烟草公司遵义市公司项目“遵义烟区烤烟品种筛选布局与后备品种选育研究”{遵烟计[2016]07号}
作者简介：赵婷婷（1996-），女，在读硕士研究生，研究方向：作物遗传育种。E-mail：ttzhao5153@qq.com。*通信作者，E-mail：rxliu@gzu.edu.cn
收稿日期：2019-09-06 修回日期：2019-12-16