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科技项目：广东省湛江市科技攻关项目（NO：2008C02015）
作者单位：524037 广东省湛江中心人民医院
通讯作者：吴越宏
【摘要】 目的 探讨乌司他丁对胰腺炎手术患者脂氧素及核因子кB基因表达的影响。方法 选择胰腺炎大手术成人患者30例，随机分为乌司他丁组（A组）和对照组（B组）。乌司他丁组于术前、术后第1、2、3 d分别给予乌司他丁30万U+生理盐水100 ml静脉滴注，各组于手术结束时、术后第1、2、3 d抽取患者静脉血2 ml分离单核粒细胞，利用凝胶电泳迁移率变化分析（EMSA）的方法测定核因子кB（NF-кB）、TNF-ɑ、IL-6、IL-8的活性，并利用聚合酶链反应方法（PCR）测定其基因表达。结果 乌司他丁组有防止术后产生全身炎症反应综合征的作用，该药能有效促进脂氧素和抑制核因子кB基因表达，抑制TNF-ɑ、IL-6、IL-8等炎症介质的释放，从而产生对抗手术侵袭和防止术后并发症的作用。结论 乌司他丁对胰腺炎手术患者脂氧素、核因子кB、TNF-ɑ、IL-6、IL-8都有抑制作用，从而防止术后产生全身炎症反应综合征的作用机制。
【关键词】 乌司他丁； 胰腺炎； 脂氧素； 核因子кB； 基因表达
探讨研究乌司他丁对胰腺炎手术患者脂氧素、核因子кB、TNF-ɑ、IL-6、IL-8的基因表达，从而探讨乌司他丁防止术后产生全身炎症反应综合征的作用机制。预期该药能有效促进脂氧素和抑制核因子кB基因表达。抑制TNF-ɑ、IL-6、IL-8等炎症介质的释放，从而进一步探讨其产生对抗手术侵袭和防止术后并发症的作用，为临床应用乌司他丁对抗手术侵袭提供更充足的理论依据，现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料 选择胰腺炎大手术成人患者30例，随机分为乌司他丁组和对照组，每组各15例。乌司他丁组于术前、术后第1、2、3 d分别给予乌司他丁30万U+生理盐水100 ml静脉滴注，对照组不使乌司他丁（天普洛安公司产品）。
1.2 方法 各组于手术结束时、术后第1、2、3 d抽取患者静脉血2 ml分离单核粒细胞，利用凝胶电泳迁移率变化分析（EMSA）的方法测定核因子кB（NF-кB）、TNF-ɑ、IL-6、IL-8的活性，并利用聚合酶链反应方法（PCR）测定其基因表达。采用NEOGEN公司提供的脂氧素（L）试验盒利用酶链免疫吸附（EIISA）测定脂氧素表达情况。
1.3 标本制备与贮存 单核细胞的提取：分离细胞，调整细胞数总量约为1×107 个，用于抽提核结合蛋白质及总RNA。核蛋白提取后置-80 ℃冻存备用；总RNA抽提分离后加入30～50 ul DEPC水溶液RNA，于-80 ℃保存。
1.4 统计学方法 采用SPSS 10.0软件包处理，计量资料以x±s表示，组内比较用t检验，组间比较采用分差分析，计数资料比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
两组患者不同时间血浆NF-кB、TNF-ɑ、IL-8、IL-6、脂氧素水平比较见表1。
两组NF-кB活性在术后1天后逐渐升高，术后2天达到峰值，然后下降，但术后3天依然高于术前水平；A组NF-кB活性在术后1、2、3天均低于B组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
两组术后TNF-ɑ、IL-6、IL-8水平均比术前明显升高（P<0.05），术后2天达高峰，之后逐渐下降。
两组术后脂氧素合成平均比术前明显增加（P<0.05），术后2天达高峰，之后逐渐下降，A组术后的脂氧素合成比B组明显增加（P>0.05），两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
SIRS是胰腺炎外科手术后的一种严重并发症，可以直接导致肺损伤、肝肾功能不全以及伤口愈合延迟，甚至导致多器官功能衰竭（MODS），严重影响患者手术预后。研究表明外科手术在发挥治疗作用的同时也可使机体产生应激反应［1］，激活SIRS是胰腺炎外科手术后的一种严重并发症，可以直接激活机体内参与全身炎症反应的多种相关炎症介质，造成细胞因子瀑布样级联反应和白细胞过度激活，释放大量氧自由基及溶酶体酶，可直接破坏细胞膜及毛细血管内皮细胞，加重机体各器官的损伤。参与术后全身炎症反应的主要介质有TNF-ɑ、IL-6、IL-8。TNF是出现最早且最重要的
炎性介质。近年来，围术期中防止术后产生全身炎症反应综合征的治疗手段愈来愈受到国内外学者的关注。国内外多项研究认为，乌司他丁有防止术后产生全身炎症反应综合征的作用［2］，其作用机制可能为抑制多种蛋白酶活性，预防细胞因子级联反应，抑制白细胞过度激活及炎症介质的释放，阻断细胞因子炎性介质与白细胞之间的恶性循环作用，减轻各种蛋白酶对重要器官功能的损害，但其作用的中心环节还有待进一步探讨。
目前国外大量研究认为脂氧素（Lipoxins）合成增加和NF-кB合成减少都标志着炎症的消退［3，4］。脂氧素是一种内源性促进炎症消退的脂氧合酶［5,6］，在体内主要是通过血小板与中性粒细胞或内皮细胞与中性粒细胞相互作用，通过跨细胞通道生物合成的。可有效阻止中性粒细胞通过毛细血管后小静脉进入炎症组织。同时可以促进巨噬细胞对调亡细胞的吞噬清除作用，有利于炎症的消除。
NF-кB是一种能与多种细胞基因的启动子和增强子中的кB序列位点发生特异结合的核转录因子［7,8］，在SIRS发展为MODS的过程中起到瓶颈的作用，主要表现为：（1）可以调控炎症介质的产生，Nemeth等研究发现NF-кB可使炎症介质（如TNF-ɑ、IL-12、MCP-1、NO等）的产生增加，而使抗炎介质（1L-10）的产生减少，促使炎症进一步扩大；（2）NF-кB可以促使炎症细胞的活化，使内皮细胞受损造成微血管通透性增加，微循环障碍，成为器官功能障碍的始发环节；（3）介导内皮细胞与白细胞的相互作用，促使PMN与内皮细胞黏附，并在 IL-8趋化因子的作用下从内皮细胞间跨膜游出，向各个器官的实质细胞浸润，释放多种炎症介质，引起各生命器官毛细血管内皮细胞损伤，通透性增高，导致实质细胞损伤和MODS。
本课题拟在围术期中应用乌司他丁，采用凝胶电泳迁移率变化分析法（EMSA）、酶链免疫吸附（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）等分子生物学手段，探讨乌司他丁对脂氧素、NF-кB、TNF-ɑ、IL-6、IL-8的活性及其基因表达的影响，进一步探讨其防止术后产生全身炎症反应综合征（SIRS）的作用机制。
经过本课题研究，笔者认为乌司他丁对胰腺炎手术后，患者脂氧素、核因子кB、TNF-ɑ、IL-6、IL-8都有抑制作用，能防止术后产生全身炎症反应综合征的作用。
参 考 文 献
［1］ 田大广，李晓延，李立.乌司他丁对腹部手术后细胞因子及肾功能的影响.昆明医学院学报,2002,（4）:43-45.
［2］ 邵义明.马司他丁用于开胸术后全身炎症反应综合征患者的临床研究.中国急救医学，2004,24（3）:173-174.
［3］ Toby Lawrence,Derek A Willoughby，Derek W，et al. Anti-inflammatory lipid mediators and insights into the resolution Of inflammation. Nature Reviews Immunology，2002，10（2）：787-795.
［4］ Serhan CN.Lipoxins and aspirin-triggered l5-epi-lipoxin biosynthesis：an update and rolein anti-inflammation and pro-resolution.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2002，8（68）:433-455.
［5］ Filep JG, Zould C,Petasis NA, et al.Lipoxin A4 andaspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 modulate adhesion molecule expression on human leukocytes in whole blood and inhibit neutrophil-endothelial cell adhesion. Adv Exp Med Biol，2002，507:223-228.
［6］ Gavins FN,Yona S，Kamal AM, et al. Leukocyte antiadhesive actions Of annexln l: ALXR- and FPR-related anti-inflammatory mechanisms. Blood，2003，101（10）：4140-4147.
［7］ lin J, Yan GT. Function Of eukaryotic transcription factor NF-kappaB in the signal transduction of acute inflammatory response. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue，2003，15（1）: 45-48.
［8］ 张少波，方国恩.核因子-кB在多器官功能障碍综合征中的作用.中华创伤杂志，2003，19（2）：123-125.
（收稿日期：2011-02-21）
（本文编辑：郎威）
作者单位：524037 广东省湛江中心人民医院
通讯作者：吴越宏
【摘要】 目的 探讨乌司他丁对胰腺炎手术患者脂氧素及核因子кB基因表达的影响。方法 选择胰腺炎大手术成人患者30例，随机分为乌司他丁组（A组）和对照组（B组）。乌司他丁组于术前、术后第1、2、3 d分别给予乌司他丁30万U+生理盐水100 ml静脉滴注，各组于手术结束时、术后第1、2、3 d抽取患者静脉血2 ml分离单核粒细胞，利用凝胶电泳迁移率变化分析（EMSA）的方法测定核因子кB（NF-кB）、TNF-ɑ、IL-6、IL-8的活性，并利用聚合酶链反应方法（PCR）测定其基因表达。结果 乌司他丁组有防止术后产生全身炎症反应综合征的作用，该药能有效促进脂氧素和抑制核因子кB基因表达，抑制TNF-ɑ、IL-6、IL-8等炎症介质的释放，从而产生对抗手术侵袭和防止术后并发症的作用。结论 乌司他丁对胰腺炎手术患者脂氧素、核因子кB、TNF-ɑ、IL-6、IL-8都有抑制作用，从而防止术后产生全身炎症反应综合征的作用机制。
【关键词】 乌司他丁； 胰腺炎； 脂氧素； 核因子кB； 基因表达
探讨研究乌司他丁对胰腺炎手术患者脂氧素、核因子кB、TNF-ɑ、IL-6、IL-8的基因表达，从而探讨乌司他丁防止术后产生全身炎症反应综合征的作用机制。预期该药能有效促进脂氧素和抑制核因子кB基因表达。抑制TNF-ɑ、IL-6、IL-8等炎症介质的释放，从而进一步探讨其产生对抗手术侵袭和防止术后并发症的作用，为临床应用乌司他丁对抗手术侵袭提供更充足的理论依据，现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料 选择胰腺炎大手术成人患者30例，随机分为乌司他丁组和对照组，每组各15例。乌司他丁组于术前、术后第1、2、3 d分别给予乌司他丁30万U+生理盐水100 ml静脉滴注，对照组不使乌司他丁（天普洛安公司产品）。
1.2 方法 各组于手术结束时、术后第1、2、3 d抽取患者静脉血2 ml分离单核粒细胞，利用凝胶电泳迁移率变化分析（EMSA）的方法测定核因子кB（NF-кB）、TNF-ɑ、IL-6、IL-8的活性，并利用聚合酶链反应方法（PCR）测定其基因表达。采用NEOGEN公司提供的脂氧素（L）试验盒利用酶链免疫吸附（EIISA）测定脂氧素表达情况。
1.3 标本制备与贮存 单核细胞的提取：分离细胞，调整细胞数总量约为1×107 个，用于抽提核结合蛋白质及总RNA。核蛋白提取后置-80 ℃冻存备用；总RNA抽提分离后加入30～50 ul DEPC水溶液RNA，于-80 ℃保存。
1.4 统计学方法 采用SPSS 10.0软件包处理，计量资料以x±s表示，组内比较用t检验，组间比较采用分差分析，计数资料比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
两组患者不同时间血浆NF-кB、TNF-ɑ、IL-8、IL-6、脂氧素水平比较见表1。
两组NF-кB活性在术后1天后逐渐升高，术后2天达到峰值，然后下降，但术后3天依然高于术前水平；A组NF-кB活性在术后1、2、3天均低于B组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
两组术后TNF-ɑ、IL-6、IL-8水平均比术前明显升高（P<0.05），术后2天达高峰，之后逐渐下降。
两组术后脂氧素合成平均比术前明显增加（P<0.05），术后2天达高峰，之后逐渐下降，A组术后的脂氧素合成比B组明显增加（P>0.05），两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
SIRS是胰腺炎外科手术后的一种严重并发症，可以直接导致肺损伤、肝肾功能不全以及伤口愈合延迟，甚至导致多器官功能衰竭（MODS），严重影响患者手术预后。研究表明外科手术在发挥治疗作用的同时也可使机体产生应激反应［1］，激活SIRS是胰腺炎外科手术后的一种严重并发症，可以直接激活机体内参与全身炎症反应的多种相关炎症介质，造成细胞因子瀑布样级联反应和白细胞过度激活，释放大量氧自由基及溶酶体酶，可直接破坏细胞膜及毛细血管内皮细胞，加重机体各器官的损伤。参与术后全身炎症反应的主要介质有TNF-ɑ、IL-6、IL-8。TNF是出现最早且最重要的
炎性介质。近年来，围术期中防止术后产生全身炎症反应综合征的治疗手段愈来愈受到国内外学者的关注。国内外多项研究认为，乌司他丁有防止术后产生全身炎症反应综合征的作用［2］，其作用机制可能为抑制多种蛋白酶活性，预防细胞因子级联反应，抑制白细胞过度激活及炎症介质的释放，阻断细胞因子炎性介质与白细胞之间的恶性循环作用，减轻各种蛋白酶对重要器官功能的损害，但其作用的中心环节还有待进一步探讨。
目前国外大量研究认为脂氧素（Lipoxins）合成增加和NF-кB合成减少都标志着炎症的消退［3，4］。脂氧素是一种内源性促进炎症消退的脂氧合酶［5,6］，在体内主要是通过血小板与中性粒细胞或内皮细胞与中性粒细胞相互作用，通过跨细胞通道生物合成的。可有效阻止中性粒细胞通过毛细血管后小静脉进入炎症组织。同时可以促进巨噬细胞对调亡细胞的吞噬清除作用，有利于炎症的消除。
NF-кB是一种能与多种细胞基因的启动子和增强子中的кB序列位点发生特异结合的核转录因子［7,8］，在SIRS发展为MODS的过程中起到瓶颈的作用，主要表现为：（1）可以调控炎症介质的产生，Nemeth等研究发现NF-кB可使炎症介质（如TNF-ɑ、IL-12、MCP-1、NO等）的产生增加，而使抗炎介质（1L-10）的产生减少，促使炎症进一步扩大；（2）NF-кB可以促使炎症细胞的活化，使内皮细胞受损造成微血管通透性增加，微循环障碍，成为器官功能障碍的始发环节；（3）介导内皮细胞与白细胞的相互作用，促使PMN与内皮细胞黏附，并在 IL-8趋化因子的作用下从内皮细胞间跨膜游出，向各个器官的实质细胞浸润，释放多种炎症介质，引起各生命器官毛细血管内皮细胞损伤，通透性增高，导致实质细胞损伤和MODS。
本课题拟在围术期中应用乌司他丁，采用凝胶电泳迁移率变化分析法（EMSA）、酶链免疫吸附（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）等分子生物学手段，探讨乌司他丁对脂氧素、NF-кB、TNF-ɑ、IL-6、IL-8的活性及其基因表达的影响，进一步探讨其防止术后产生全身炎症反应综合征（SIRS）的作用机制。
经过本课题研究，笔者认为乌司他丁对胰腺炎手术后，患者脂氧素、核因子кB、TNF-ɑ、IL-6、IL-8都有抑制作用，能防止术后产生全身炎症反应综合征的作用。
参 考 文 献
［1］ 田大广，李晓延，李立.乌司他丁对腹部手术后细胞因子及肾功能的影响.昆明医学院学报,2002,（4）:43-45.
［2］ 邵义明.马司他丁用于开胸术后全身炎症反应综合征患者的临床研究.中国急救医学，2004,24（3）:173-174.
［3］ Toby Lawrence,Derek A Willoughby，Derek W，et al. Anti-inflammatory lipid mediators and insights into the resolution Of inflammation. Nature Reviews Immunology，2002，10（2）：787-795.
［4］ Serhan CN.Lipoxins and aspirin-triggered l5-epi-lipoxin biosynthesis：an update and rolein anti-inflammation and pro-resolution.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2002，8（68）:433-455.
［5］ Filep JG, Zould C,Petasis NA, et al.Lipoxin A4 andaspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 modulate adhesion molecule expression on human leukocytes in whole blood and inhibit neutrophil-endothelial cell adhesion. Adv Exp Med Biol，2002，507:223-228.
［6］ Gavins FN,Yona S，Kamal AM, et al. Leukocyte antiadhesive actions Of annexln l: ALXR- and FPR-related anti-inflammatory mechanisms. Blood，2003，101（10）：4140-4147.
［7］ lin J, Yan GT. Function Of eukaryotic transcription factor NF-kappaB in the signal transduction of acute inflammatory response. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue，2003，15（1）: 45-48.
［8］ 张少波，方国恩.核因子-кB在多器官功能障碍综合征中的作用.中华创伤杂志，2003，19（2）：123-125.
（收稿日期：2011-02-21）
（本文编辑：郎威）