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摘 要：用含有不同铜离子浓度的PDA平板培养菌株XLS，通过测菌落直径检测菌株的耐铜性，对菌株进行分子生物学鉴定。结果显示：当铜离子浓度为20mg·L-1时，菌落直径最大，为88.54mm，菌丝最浓密，说明在该浓度时铜离子能促进菌株XLS的生长，但效果不显著；浓度≥80mg·L-1时，菌落直径呈递减趋势；铜离子浓度为80mg·L-1时，菌落生长略微受到抑制；当铜离子浓度提高到200mg·L-1时，菌落直径下降明显，浓度为300mg·L-1时菌落直径仅为20.14mm，400mg·L-1时菌株生长完全受到抑制，该菌株对铜的最大耐受浓度≤400mg·L-1，抗铜性较强。将该序列提交到GenBank（Accession No：KY889145），根据Blast比对结果，将其初步鉴定为Nigrospora sphaerica，即球黑孢菌。
关键词：真菌；重金属污染；铜离子；球黑孢菌
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）21-0044-03
Identification and Growth Tolerance Characteristic of a Fungi Strain to Copper Ion
Zheng Aifang
（College of Life Science，Anqing Normal University，Anqing 246133，China）
Abstract：Growth tolerance characteristicf the fungi strain to copper ion was detected by culturing the fungi strain XLS on the PDA plate with different Cu2+ concentrations and measuring the colony diameter.The strain XLS was identified by molecular biology methods.The results showed that colony diameter was was 88.54 mm，it’s the biggest，when the concentration of Cu2+ was 20mg·L-1，the hyphae were dense，Cu2+ had positive effect on the growth of the stain，but the effect was not significant .Cu2+concentration above 80mg L-1，colony diameter had a descending trend.The hyphae growth was slightly inhibited at 80mg·L-1，colony diameter decreased more signifi-cantly at 200mg·L-1 and was only 20.14 mm at 300mg·L-1，the hyphae growth was completely inhibited at 400mg·L-1.The ITS sequence was submitted to GenBank （Accession NoKY889145）and the results showed that the strain XLS had a high similarity to Nigrospora sphaerica.
Key words：Fungi；Heavy metal pollutio；Cu2+；Nigrospora sphaerica
隨着工业化的发展，重金属污染日趋严重，在对空气、水体造成污染的同时，成为一种难处理的土壤和水体污染物。矿产资源在开采过程中会造成矿区附近土壤和水质的重金属污染，给人们身体健康带来了严重威胁[1，2]。为保护耕地和水资源，很多学者对重金属造成的水体和土壤污染修复进行了大量研究。土壤重金属污染的修复方法包括物理法、化学法、生物法及联合法[3]，物理和化学方法费用高、能耗大且容易造成二次污染[4-6]，因此生物处理方法成为了国内外研究的热点。当前，国内外对金属离子的生物吸附利用的吸附剂有细菌、丝状真菌、酵母和藻类及大型真菌的子实体或菌丝体[7，8]，其中利用真菌处理重金属污染成为了重要的研究方向。真菌能将大量重金属以矿化的形式从污水或土壤中分离出来，分离出来的重金属能够作为资源进行回用[9]，也避免了环境污染原位修复时重金属盐被再度活化的问题。本研究利用皖西南丰富的真菌资源，分离筛选具有强吸附铜离子能力的菌株，用以修复水体及土壤中铜离子的重金属污染，降低对人们健康的危害和影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 实验室保存的XLS菌株。
1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200g·L-1，葡萄糖20g·L-1，琼脂20g·L-1；重金属母液：浓度为2000mg·L-1、20000mg·L-1的硫酸铜母液。
1.3 菌株XLS耐铜性实验[10]
1.3.1 活化菌种 用PDA平板活化冰箱中保存的菌种，待菌落长满平板后置于冰箱备用。
1.3.2 制备含有不同铜离子浓度的平板 将铜离子母液过滤除菌，无菌条件下分别量取0、1、2、3、4mL的浓度为2000mg·L-1的铜离子母液，加入到装有100、99、98、97、96、95mL无菌PDA（60℃左右）培养基的三角瓶中，倒平板，制成含有硫酸铜浓度分别为0、20、40、60、80、100mg·L-1的固体平板；取0.5、1、1.5、2、2.5、3mL浓度为20000mg·L-1的硫酸铜母液，加入到装有99、98.5、98、97.5、97、mL无菌PDA（60℃左右）培养基中，倒平板，制成含有铜离子浓度分别为100、200、300、400、500、600mg·L-1的固体平板。 1.3.3 接种及检测 用打孔器在平板菌种的菌丝前端打取直径为6mm的菌丝块，将有菌丝的一面朝下，置于直径为9cm的含铜PDA平板的中央，每个浓度做3个重复。将接菌的平板置于28℃条件下避光培养，待其中1个平板长满菌丝后停止培养，垂直方向测定菌落的直径，取两者的均值。
1.4 基因组DNA的提取及分子生物學鉴定 收集菌株XLS菌丝，用试剂盒提取DNA。ITS基因PCR扩增：扩增引物序列为ITS1F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系（50μL）：10×PCR Buffer（withoutmg2+：100mM Tris-HCl pH 8.8 at 25℃；500 mM KCl，0.8%（v/v）Nonidet）5μL；dNTP（10 mM）1μL 、引物各1μL 、MgCl2（25mM）5μL、Taq酶（5U/μL）5μL，模板DNA1μL、ddH2O 35.5μL。PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸50s，共35个循环，72℃延伸5min，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物纯化用回收试剂盒（Axygen）回收，由上海凌恩生物科技有限公司测序。序列与NCBI网站上核酸数据库进行基因序列比对，对菌株进行初步鉴定。
2 结果与分析
2.1 菌株XLS耐铜性分析 从图1可以看出，菌株XLS菌落大小随着铜离子浓度的增加而减小，其菌落直径值见表1。当铜离子浓度为0～60mg·L-1时，菌株XLS菌落直径变化不大；浓度为20mg·L-1时菌落最大，菌落直径为88.54mm，菌丝最浓密，说明在该浓度的铜离子能促进该菌株的生长，但效果不显著；铜离子浓度高于60mg·L-1，菌落直径呈递减趋势，铜离子浓度为80mg·L-1时菌落生长略微受到抑制；当铜离子浓度提高到200mg·L-1时，菌落直径下降明显，菌落直径为52.88mm，缩小40%；浓度为300mg·L-1时菌落直径仅为20.14mm，400mg·L-1时菌株受到完全抑制，说明该菌株对铜的最大耐受浓度在300～400mg·L-1。
2.2 菌株XLS的鉴定 用真菌通用引物ITS1F和ITS4R引物对真菌XLS菌株进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳后显示该菌株的PCR产物条带位于500～600bp（图2），该ITS 序列为545bp，将该序列提交到GenBank（Accession No：KY889145），进行Blast，结果显示：菌株XLS与GenBank 中Nigrospora sphaerica（GQ851731.1，KJ76712 1.1，KX271308.1，GQ851722.1，GQ919076.1）5个菌株的ITS序列覆盖度在100%，相似性达到99%。根据此分子生物学特性，将其初步鉴定为Nigrospora sphaerica，即球黑孢菌。
3 结论与讨论
菌株XLS经鉴定为Nigrospora sphaerica，即球黑孢菌，能够在含有高浓度的铜离子培养基中生长，铜离子浓度20mg·L-1时对菌株生长有促进作用，效果不明显。铜离子浓度超过80mg·L-1时，菌株生长受抑制，200mg·L-1时抑制效果显著，菌落直径耐受最高铜离子浓度为300mg·L-1，超过400mg·L-1生长受到完全抑制。菌株XLS对高浓度铜离子有较强的耐受性，具有作为吸附剂处理铜离子造成的水污染的潜力。
目前还未有利用球黑孢菌处理铜离子污染的研究报导，后续将进一步研究该菌株处理铜离子废水的影响因素，优化最佳条件，如：菌丝球投加量、pH、温度、转速、初始铜离子浓度、吸附时间等因素对该菌株在液体条件下生物吸附Cu2+ 的影响，为其进一步应用提供实验依据。
参考文献
[1]Mata Y N，Blázquez M L，Ballester A，et al.Biosorption of cadmium，lead and copper with calcium alginate xerogels andimmobilized Fucus vesiculosus[J].J Hazard Mater，2009，163（2-3）：555-562.
[2]洪利明，刘晓作，刘林海，等.浊点萃取-分光光度法测定水样中的痕量铜[J].上饶师范学院学报，2016，36（03）：75-78.
[3]郭莹，秦玉莹，鞠天琛，等.一株穗花狐尾藻内生菌的分离鉴定及其溶磷特征研究[J].环境科学学报，2016，36（12）：4352-4360.
[4]Pagnanelli F，Trifoni M，Beolchini F，et al. Equilibrium biosorption studies in single and multi-metal systems[J].Process Biochem，2001，37（2）：115-124.
[5]Kadirvelu K，Senthilkumar P，Thamaraiselvi K，et al. Activated carbon prepared from biomass as adsorbent：elimination of Ni（Ⅱ）from aqueous solution[J].Biores Technol，2002，81（1）：87-90.
[6]Gaetke LM，Chow CK. Copper toxicity，oxidative stress，and antioxidant nutrients[J].Toxicology，2003，189（1-2）：147-163.
[7]刘月英，傅锦坤，陈平，等.巨大芽孢杆菌 D01 吸附金（Au3+）的研究[J].微生物学报，2000，40（4）：425-429.
[8]高健伟，张丹，陈红，等.蕈菌菌丝体死细胞对水溶液中微量铅离子的吸附[J].工业用水与废水，2006，37（4）：23-26.
[9]Bulgariu D，Bulgariu L Equilibrium and kinetics studies ofheavy metal ions biosorption on green algae waste biomass[J].Bioresource Technology，2012，103（1）：489-493.
[10]张晓柠.灵芝对四种重金属富集作用的研究[D].北京：中国协和医科大学，中国医学科学院，2007.
（责编：张宏民）
关键词：真菌；重金属污染；铜离子；球黑孢菌
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）21-0044-03
Identification and Growth Tolerance Characteristic of a Fungi Strain to Copper Ion
Zheng Aifang
（College of Life Science，Anqing Normal University，Anqing 246133，China）
Abstract：Growth tolerance characteristicf the fungi strain to copper ion was detected by culturing the fungi strain XLS on the PDA plate with different Cu2+ concentrations and measuring the colony diameter.The strain XLS was identified by molecular biology methods.The results showed that colony diameter was was 88.54 mm，it’s the biggest，when the concentration of Cu2+ was 20mg·L-1，the hyphae were dense，Cu2+ had positive effect on the growth of the stain，but the effect was not significant .Cu2+concentration above 80mg L-1，colony diameter had a descending trend.The hyphae growth was slightly inhibited at 80mg·L-1，colony diameter decreased more signifi-cantly at 200mg·L-1 and was only 20.14 mm at 300mg·L-1，the hyphae growth was completely inhibited at 400mg·L-1.The ITS sequence was submitted to GenBank （Accession NoKY889145）and the results showed that the strain XLS had a high similarity to Nigrospora sphaerica.
Key words：Fungi；Heavy metal pollutio；Cu2+；Nigrospora sphaerica
隨着工业化的发展，重金属污染日趋严重，在对空气、水体造成污染的同时，成为一种难处理的土壤和水体污染物。矿产资源在开采过程中会造成矿区附近土壤和水质的重金属污染，给人们身体健康带来了严重威胁[1，2]。为保护耕地和水资源，很多学者对重金属造成的水体和土壤污染修复进行了大量研究。土壤重金属污染的修复方法包括物理法、化学法、生物法及联合法[3]，物理和化学方法费用高、能耗大且容易造成二次污染[4-6]，因此生物处理方法成为了国内外研究的热点。当前，国内外对金属离子的生物吸附利用的吸附剂有细菌、丝状真菌、酵母和藻类及大型真菌的子实体或菌丝体[7，8]，其中利用真菌处理重金属污染成为了重要的研究方向。真菌能将大量重金属以矿化的形式从污水或土壤中分离出来，分离出来的重金属能够作为资源进行回用[9]，也避免了环境污染原位修复时重金属盐被再度活化的问题。本研究利用皖西南丰富的真菌资源，分离筛选具有强吸附铜离子能力的菌株，用以修复水体及土壤中铜离子的重金属污染，降低对人们健康的危害和影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 实验室保存的XLS菌株。
1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200g·L-1，葡萄糖20g·L-1，琼脂20g·L-1；重金属母液：浓度为2000mg·L-1、20000mg·L-1的硫酸铜母液。
1.3 菌株XLS耐铜性实验[10]
1.3.1 活化菌种 用PDA平板活化冰箱中保存的菌种，待菌落长满平板后置于冰箱备用。
1.3.2 制备含有不同铜离子浓度的平板 将铜离子母液过滤除菌，无菌条件下分别量取0、1、2、3、4mL的浓度为2000mg·L-1的铜离子母液，加入到装有100、99、98、97、96、95mL无菌PDA（60℃左右）培养基的三角瓶中，倒平板，制成含有硫酸铜浓度分别为0、20、40、60、80、100mg·L-1的固体平板；取0.5、1、1.5、2、2.5、3mL浓度为20000mg·L-1的硫酸铜母液，加入到装有99、98.5、98、97.5、97、mL无菌PDA（60℃左右）培养基中，倒平板，制成含有铜离子浓度分别为100、200、300、400、500、600mg·L-1的固体平板。 1.3.3 接种及检测 用打孔器在平板菌种的菌丝前端打取直径为6mm的菌丝块，将有菌丝的一面朝下，置于直径为9cm的含铜PDA平板的中央，每个浓度做3个重复。将接菌的平板置于28℃条件下避光培养，待其中1个平板长满菌丝后停止培养，垂直方向测定菌落的直径，取两者的均值。
1.4 基因组DNA的提取及分子生物學鉴定 收集菌株XLS菌丝，用试剂盒提取DNA。ITS基因PCR扩增：扩增引物序列为ITS1F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系（50μL）：10×PCR Buffer（withoutmg2+：100mM Tris-HCl pH 8.8 at 25℃；500 mM KCl，0.8%（v/v）Nonidet）5μL；dNTP（10 mM）1μL 、引物各1μL 、MgCl2（25mM）5μL、Taq酶（5U/μL）5μL，模板DNA1μL、ddH2O 35.5μL。PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸50s，共35个循环，72℃延伸5min，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物纯化用回收试剂盒（Axygen）回收，由上海凌恩生物科技有限公司测序。序列与NCBI网站上核酸数据库进行基因序列比对，对菌株进行初步鉴定。
2 结果与分析
2.1 菌株XLS耐铜性分析 从图1可以看出，菌株XLS菌落大小随着铜离子浓度的增加而减小，其菌落直径值见表1。当铜离子浓度为0～60mg·L-1时，菌株XLS菌落直径变化不大；浓度为20mg·L-1时菌落最大，菌落直径为88.54mm，菌丝最浓密，说明在该浓度的铜离子能促进该菌株的生长，但效果不显著；铜离子浓度高于60mg·L-1，菌落直径呈递减趋势，铜离子浓度为80mg·L-1时菌落生长略微受到抑制；当铜离子浓度提高到200mg·L-1时，菌落直径下降明显，菌落直径为52.88mm，缩小40%；浓度为300mg·L-1时菌落直径仅为20.14mm，400mg·L-1时菌株受到完全抑制，说明该菌株对铜的最大耐受浓度在300～400mg·L-1。
2.2 菌株XLS的鉴定 用真菌通用引物ITS1F和ITS4R引物对真菌XLS菌株进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳后显示该菌株的PCR产物条带位于500～600bp（图2），该ITS 序列为545bp，将该序列提交到GenBank（Accession No：KY889145），进行Blast，结果显示：菌株XLS与GenBank 中Nigrospora sphaerica（GQ851731.1，KJ76712 1.1，KX271308.1，GQ851722.1，GQ919076.1）5个菌株的ITS序列覆盖度在100%，相似性达到99%。根据此分子生物学特性，将其初步鉴定为Nigrospora sphaerica，即球黑孢菌。
3 结论与讨论
菌株XLS经鉴定为Nigrospora sphaerica，即球黑孢菌，能够在含有高浓度的铜离子培养基中生长，铜离子浓度20mg·L-1时对菌株生长有促进作用，效果不明显。铜离子浓度超过80mg·L-1时，菌株生长受抑制，200mg·L-1时抑制效果显著，菌落直径耐受最高铜离子浓度为300mg·L-1，超过400mg·L-1生长受到完全抑制。菌株XLS对高浓度铜离子有较强的耐受性，具有作为吸附剂处理铜离子造成的水污染的潜力。
目前还未有利用球黑孢菌处理铜离子污染的研究报导，后续将进一步研究该菌株处理铜离子废水的影响因素，优化最佳条件，如：菌丝球投加量、pH、温度、转速、初始铜离子浓度、吸附时间等因素对该菌株在液体条件下生物吸附Cu2+ 的影响，为其进一步应用提供实验依据。
参考文献
[1]Mata Y N，Blázquez M L，Ballester A，et al.Biosorption of cadmium，lead and copper with calcium alginate xerogels andimmobilized Fucus vesiculosus[J].J Hazard Mater，2009，163（2-3）：555-562.
[2]洪利明，刘晓作，刘林海，等.浊点萃取-分光光度法测定水样中的痕量铜[J].上饶师范学院学报，2016，36（03）：75-78.
[3]郭莹，秦玉莹，鞠天琛，等.一株穗花狐尾藻内生菌的分离鉴定及其溶磷特征研究[J].环境科学学报，2016，36（12）：4352-4360.
[4]Pagnanelli F，Trifoni M，Beolchini F，et al. Equilibrium biosorption studies in single and multi-metal systems[J].Process Biochem，2001，37（2）：115-124.
[5]Kadirvelu K，Senthilkumar P，Thamaraiselvi K，et al. Activated carbon prepared from biomass as adsorbent：elimination of Ni（Ⅱ）from aqueous solution[J].Biores Technol，2002，81（1）：87-90.
[6]Gaetke LM，Chow CK. Copper toxicity，oxidative stress，and antioxidant nutrients[J].Toxicology，2003，189（1-2）：147-163.
[7]刘月英，傅锦坤，陈平，等.巨大芽孢杆菌 D01 吸附金（Au3+）的研究[J].微生物学报，2000，40（4）：425-429.
[8]高健伟，张丹，陈红，等.蕈菌菌丝体死细胞对水溶液中微量铅离子的吸附[J].工业用水与废水，2006，37（4）：23-26.
[9]Bulgariu D，Bulgariu L Equilibrium and kinetics studies ofheavy metal ions biosorption on green algae waste biomass[J].Bioresource Technology，2012，103（1）：489-493.
[10]张晓柠.灵芝对四种重金属富集作用的研究[D].北京：中国协和医科大学，中国医学科学院，2007.
（责编：张宏民）