探讨miRNA-34a(miR-34a)靶向高迁移率族蛋白B1(HMGB1)逆转骨肉瘤细胞顺铂耐药的相关机制。
方法采用剂量递增间歇作用的方法构建MG-63顺铂耐药细胞株(MG-63/DDP)。使用不同浓度顺铂(0、1、5、10、20、30 μg/ml)处理MG-63/DDP细胞,采用CCK-8法检测细胞存活率。将MG-63/DDP细胞分别转染miR-34a过表达载体(miR-34a过表达载体组)及miR-34a空表达载体(miR-34a-NC组),采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-34a的相对表达量;使用不同浓度顺铂(0、1、5、10、20、30 μg/ml)处理细胞,采用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-34a是否调控HMGB1的表达,蛋白质印迹法检测转染后细胞的HMGB1蛋白表达量。将MG-63/DDP细胞分别转染HMGB1基因沉默载体(si-HMGB1组)及其阴性对照载体(si-NC组),采用蛋白质印迹法检测HMGB1蛋白表达量;CCK-8法检测细胞存活率。
结果MG-63/DDP细胞株构建成功。不同浓度顺铂作用后,MG-63/DDP细胞存活率均高于MG-63细胞(均P<0.01)。MG-63/DDP细胞和MG-63细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50)分别为25.80 μg/ml和0.47 μg/ml。MG-63/DDP细胞中miR-34a相对表达量低于MG-63细胞(0.46±0.04比1.02±0.05,t=15.14,P<0.01);与miR-34a-NC组相比,miR-34a过表达载体组MG-63/DDP细胞中miR-34a相对表达量增加(1.67±0.09比1.00±0.02,t=-12.58,P<0.01)。miR-34a过表达载体组、miR-34a-NC组细胞存活率随着顺铂浓度增加而降低,5~30 μg/ml顺铂作用后,miR-34a过表达载体组细胞存活率均低于miR-34a-NC组(均P<0.01)。20 μg/ml顺铂处理24 h后,miR-34a-NC组和miR-34a过表达载体组MG-63/DDP细胞凋亡率分别为(25.1±1.7)%、(42.3±2.3)%,miR-34a过表达载体组MG-63/DDP细胞具有更高的凋亡率(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,与miR-34a-NC组相比,miR-34a过表达载体组能够抑制PGL3-野生型-HMGB1荧光素酶活性,差异具有统计学意义(t=6.37,P<0.01),而miR-34a过表达载体组对PGL3-突变型-HMGB1荧光素酶活性无明显抑制效果(t=0.35,P=0.74)。miR-34a过表达载体组HMGB1蛋白相对表达量低于miR-34a-NC组(0.43±0.02比1.00±0.14,t=6.98,P<0.01)。与si-NC组相比,si-HMGB1组HMGB1蛋白相对表达量及IC50均降低(均P<0.05)。
结论miR-34a过表达能够增强骨肉瘤细胞MG-63/DDP对顺铂的化学敏感性,其作用机制可能与抑制HMGB1的表达有关。