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摘要 目的：评价确证天麻硫熏标志物（p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite）和硫熏天麻水提物的细胞毒性。方法：采用CCK-8试验方法，考察天麻硫熏标志物和水提物不同剂量下人肾皮质近曲小管上皮细胞、人正常肝细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的生长情况，计算相应的细胞活力，并根据相对增殖率进行细胞毒性评级。结果：硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite对于人体2种细胞的生长均表现出良好的促进作用，且参照《美国药典》的毒性分级法，得出该标志物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的安全剂量范围为0～1 000 μmol/L。另外发现，硫熏天麻水提物对人体正常细胞的细胞活力影响不大，与硫熏前的差异无统计学意义（P>0.05），并得出该标志物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的安全剂量范围为0～2.5 μg/mL。结论：在正常的浓度范围内，硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite和硫熏天麻提取物均无细胞毒性，对细胞活力的影响不大。
关键词 天麻;硫熏标志物;p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite;水提物;细胞毒性
Cytotoxicity Evaluation of Sulfur Fumigation Gastrodia Rhizoma Markers and Water Extracts
Kang Chuanzhi，Lyu Chaogeng，Wang Sheng，Wang Tielin，Sun Jiahui，Wang Hongyang，Zhou Li，Guo Lanping
（State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）
Abstract Objective：To evaluate the cytotoxicity of the water extract and p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite in sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma.Methods：The CCK-8 test method was used to investigate the growth of human renal cortical proximal tubular epithelial cells，human normal hepatocytes and rat adrenal pheochromocytoma cells at different doses of sulfur-fumigated markers and water extracts for Gastrodia Rhizoma.And the vitality and cytotoxicity ratings based on relative proliferation rates was also evaluated.Results：The p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite had a good promoting effect on the growth of both human cells，and the toxicity of the United States Pharmacopoeia was used to obtain the marker for rat adrenal pheochromocytoma cells.The safe dose range was from 0 to 1000 μmol/L.In addition，it was found that the water extract of sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma had little effect on the cell viability of normal human cells，and there was no significant difference（P>0.05）before and after of sulfur-fumigating Gastrodia Rhizoma，and the safe dose range of the marker on rat adrenal pheochromocytoma cells was 0～2.5 μg/mL.Conclusion：In the normal concentration range，the p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite and water extract of sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma were not cytotoxic，and had little effect on cell viability.
Key Words Gastrodia Rhizoma; Chemical markers of sulfur fumigation; p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite; Water extract; Cytotoxicity
中图分类号：R282.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.004
硫磺熏蒸（以下简称“硫熏”）加工方法作為传统的中药材养护方法，具有快速干燥、漂白、防霉、防虫和延长贮藏期等作用，已广泛应用到中药材的初加工和仓储等环节[1-3]。当前中药材硫熏滥用现象极为普遍，尤其是在产地加工和贮藏保管等环节。但大量研究已证实硫熏不仅会影响药材质量，残留过量的二氧化硫还会危害人体健康，尤其是药材进入人体后，对肝和肾脏等重要代谢器官的影响较大[4-9]。课题组前期在对硫熏天麻质量评价的研究中发现并获得了硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite（p-HS），作为评价天麻硫熏质量控制的重要评价指标[10-11]，但对该硫熏标志物的安全性问题还不得而知。另外，大部分中药材的服用方式以煎煮为主，因此对硫熏天麻药材煎煮后的提取物进行安全性评价也是很有必要的。 因此，本研究选取了人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）人正常肝细胞（L-02）和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）作为研究评价对象，考察了p-HS标志物和硫熏天麻水提物不同剂量对人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）、人正常肝细胞（L-02）和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）的影响，观察各剂量下HK-2细胞、L-02细胞和PC-12细胞的生长情况，并根据PC-12细胞相对增殖率（Relative Growth Rate，RGR）对硫熏产物p-HS和硫熏药材提取物进行细胞毒性评级，为中药材硫磺熏蒸安全性评价提供参考，也为中药材二氧化硫限量标准的制定提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 二氧化碳培养箱（HERAEUS公司，德国，型号：BB16）;倒置显微镜（Olympus公司，日本，型号：XSZ-D）;全波长酶标仪（thermo公司，芬兰，型号：Multiskan Go-1510）;超低温冰箱（三洋公司，日本，型号：MDF-U5412）;96孔培养板（Corning公司，美国，型号：Corning3599）;台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16C）;电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司，型号：AL104）;电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：DK-98-ⅡA）。
1.2 试剂 CCK-8试剂（碧云天公司，中国，批号：C0038）;DMEM（Gibco BRL公司，美国，批号：12400024）;新生牛血清（杭州四季青生物工程有限公司，批号：22011-8615）;胰蛋白酶（Amresco公司，美国，批号：0785-5G）;二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国，批号：D4540-1L）;注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：H13020657）;注射用硫酸链霉素（大连美罗药厂，批号：H21021674）;PBS（Amresco公司，美国，批号：DZ0231）。
1.3 分析样品 天麻新鲜样品于2017年11月采自贵州省大方县的乌天麻，经中国中医科学院中药资源中心郭兰萍研究员鉴定为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的新鲜块茎，样本存放于中国中医科学院中药资源中心。天麻硫熏标志物p-HS由中国中医科学院中药资源中心分离制备获得[10]。人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2，编号：BNCC338012）;人正常肝细胞（L-02，编号：BNCC100012）;大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12，编号：BNCC 337663），以上3种细胞购于上海宸功生物技术有限公司。
2 方法
2.1 天麻药材硫熏处理方法 取新鲜的天麻样品适量，洗净晾干表面的水分，切成薄片后，分成2组，一组为空白对照组，另外一组按照硫磺与药材用量比1∶40，硫熏1 h的硫熏工艺进行硫熏处理。取出后置于50 ℃烘干，放置于4 ℃保存，备用。
2.2 天麻水提物和p-HS标志物母液制备 天麻p-HS标志物母液配制：取p-HS 1.88 mg（即0.01 mmol）溶于含有1‰ DMSO的10 mL培養液，混匀后于4 ℃冰箱中保存。天麻水提物：分别取硫熏前后的干燥天麻药材100 g，先浸泡30 min，取出后进行煎煮，分2次进行，第1次加10倍量的水，煎煮40 min，第2次加6倍量水，煎煮20 min，滤过，合并滤液，室内减压回收溶剂或冻干得到4份待测样品。其中，天麻（TM）、硫熏天麻（TM-S）水提物的质量分别为20.84 g和17.09 g。根据水提物和药材质量比值，计算得到2份样品的提取率分别为20.32%和16.99%。
2.3 样品剂量设置 天麻p-HS标志物：根据细胞抑制率情况以r=10，设置5个浓度梯度，分别为0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L和1 000 μmol/L，观察细胞生长情况及状态。天麻提取液：根据HK-2和L-02细胞抑制率情况，设置5个浓度梯度，分别为1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL，观察细胞生长情况及状态。根据PC-12细胞的抑制率情况，将浓度梯度设置为0.1 μg/mL，0.5 μg/mL，2.5 μg/mL，12.5 μg/mL，62.5 μg/mL。
2.4 细胞培养方法 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基传代培养，每2～3 d传代1次，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
2.5 CCK-8试验方法 分别将处于对数生长期的HK-2、L-02和PC-12细胞经胰酶消化后，制成细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，边缘孔用无菌PBS填充。置5% CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的p-HS，设置6个浓度梯度，同时设置不加药的阴性平行对照组。每孔100 μL，设6个复孔。培养24 h后避光加入CCK-8溶液10 μL，置培养箱中继续培养2 h。在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光度，计算细胞活力，并将处理组与对照组进行统计分析，重复实验3次。
2.6 细胞相对增殖率（RGR，%）及细胞抑制率（%）的计算 相对增殖率（RGR，%）=（实验组吸光度均值/对照组吸光度均值）×100%;细胞抑制率（%）=1-相对增殖率（%）。
2.7 细胞毒性评级标准 根据RGR值，参照《美国药典》毒性分级法[12]评价细胞毒性，评价标准为：1）RGR值≥100%为0级;2）75%≤RGR值<100%为Ⅰ级;3）50%≤RGR值<75%为Ⅱ级;4）25%≤RGR值<50%为Ⅲ级;5）1%≤RGR值<25%为Ⅳ级;6）0≤RGR值<1%为Ⅴ级。
3 结果 3.1 p-HS对HK-2、L-02和PC-12细胞活性的影响 给予人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）和人正常肝细胞（L-02）不同剂量的p-HS（0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L，1 000 μmol/L）处理后，均可不同程度的促进HK-2和L-02细胞的生长。结果见表1和图1。
CCK-8法检测HK-2和L-02细胞培养液中细胞生长和增殖活性研究显示：与正常对照组比较，p-HS药物对HK-2和L-02细胞均具有不同程度的促进作用，且随剂量浓度的增加促进作用加强，当浓度为100 μmol/L时，细胞增殖率最高分别达到34.14%和32.04%。同时具有浓度依赖关系，但当药物浓度达到1 000 μmol/L时，p-HS对HK-2和L-02细胞的促进作用随即减弱。
给予大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）不同剂量的p-HS均可不同程度的抑制PC-12细胞的生长。CCK-8法检测PC-12细胞培养液中细胞生长和增殖活性研究显示：与正常对照组比较，p-HS药物对PC-12细胞均具有不同程度的毒性作用，且随剂量浓度的增加抑制作用加强，具有浓度依赖关系。
3.2 p-HS对HK-2、L-02和PC-12细胞毒性等级评定 给予不同剂量的p-HS均可不同程度影响HK-2、L-02和PC-12细胞的增殖，本研究计算细胞相对增殖率对p-HS药物进行细胞毒性等级评定。一般来说，RGR>50%为合格，RGR<50%为不合格。
根据评定结果，以PC-12细胞为例。见图1。在所有设置的浓度范围内，正常组的毒性等级为0级，0.1 μmol/L组和1 μmol/L组的细胞毒性等级为Ⅰ级，剩余3组的毒性等级为Ⅱ级。按照RGR>50%的标准，得到p-HS对PC-12细胞的安全剂量范围为0～1 000 μmol/L。另外，按照上述评价方法，p-HS对HK-2和L-02细胞的安全剂量范围同样为0～1 000 μmol/L。综上所述，在合理的使用范围内，p-HS化合物对HK-2、L-02和PC-12细胞的生长是较为安全的。
3.3 天麻水提物对HK-2、L-02和PC-12细胞活性影响 分别给予HK-2、L-02和PC-12 3种细胞不同剂量的TM和TM-S样品处理，结果得到2组样品均可不同程度的抑制HK-2、L-02和PC-12细胞的生长。与正常对照组比较，上述2组样品对HK-2、L-02和PC-12均具有不同程度的抑制作用，且随剂量浓度的增加抑制作用加强，具有浓度依赖关系。见图2A、2C、2E。
比较硫熏前后天麻提取物的细胞活性发现，硫熏后的天麻药材提取物对HK-2细胞的抑制率明显低于硫熏前的，说明硫熏后的天麻药材水提物在一定程度上更有利于HK-2细胞的生长。对于L-02细胞来说，硫熏后的天麻不同剂量的提取物对L-02细胞生长的抑制作用高于硫熏前的样品，但差异无统计学意义（P>0.05），表明硫熏前后的天麻药材水提物在一定浓度范围内对HK-2细胞的抑制作用基本一致。通过对HK-2和L-02细胞活性分析，发现硫熏后的天麻提取物对人体正常HK-2和L-02细胞生长的影响虽然呈现相反的趋势，但整体来看，硫熏处理对人体正常细胞的生长影响不大。
另外，对PC-12细胞培养液中细胞生长和增殖活性研究显示，与正常对照组比较，2组样品对PC-12均具有不同程度的抑制作用，且随剂量浓度的增加促进作用加强。而且，硫熏后的天麻提取物对非正常PC-12细胞的抑制作用减弱，与硫熏前差异无统计学意义（P>0.05），但还是表现出较强的抑制作用。
3.4 天麻水提物对HK-2、L-02和PC-12细胞毒性分析 给予HK-2、L-02和PC-12细胞不同剂量的TM、TM-S、NX、NX-S样品处理，发现2组样品均可不同程度影响HK-2、L-02和PC-12细胞的增殖，且随着浓度增加增殖作用减弱。计算细胞相对增殖率（GRG）对硫熏前后天麻提取物进行细胞毒性等级评定。一般来说，RGR>50%认为安全，即0级、Ⅰ级和Ⅱ级视为安全范围。
对HK-2细胞来说（图2B），TM组的细胞安全剂量范围为0～100 μg/mL，TM-S组的安全剂量范围为0～1 000 μg/mL，说明在相同浓度下，硫熏后的天麻水提物对HK-2细胞毒性更小，安全剂量范围更宽。对L-02细胞来说（图2D），TM组的细胞安全剂量范围为0～1 000 μg/mL，TM-S组的安全剂量范围均为0～100 μg/mL。但从1 000 μg/mL剂量组看，硫熏前后天麻水提物对L-02细胞毒性基本相近，差异无统计学意义。从PC-12细胞来看（图2F），TM和TM-S2组的安全剂量范围均为0～2.5 μg/mL，说明硫熏前后天麻药材提取物对PC-12细胞增殖的影响相对一致。以上表明，硫熏天麻提取物对不同细胞产生的细胞毒性各有差异，既有促进作用，又有抑制作用，但总体上硫熏前后药材提取物对细胞毒性影响差异无统计学意义。
4 结论
4.1 明确了天麻硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite细胞毒性 课题组前期的研究中发现并分离得到了天麻硫熏标志物p-HS，该成分可作为评价天麻硫熏与否的专属性质量控制指标。为了明确该标志物对人体是否具有细胞毒性，文章考察了不同剂量p-HS对人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）、人正常肝细胞（L-02）和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）的活力的影响。分析认为当浓度范围在0～100 μmol/L时，p-HS对HK-2细胞和L-02细胞均具有不同程度的促进作用，且随剂量浓度的增加促进作用加强。当处理浓度达到1 000 μmol/L时，p-HS成分对HK-2和L-02细胞的促进作用随即减弱，但还是对细胞活力表现出促进作用。这在一定程度上说明该成分对于人体的肝细胞和肾细胞生长均表现出良好的促进作用。此外，对PC-12细胞毒性研究发现，p-HS药物对PC-12细胞均具有不同程度的抑制作用，且随剂量浓度的增加抑制作用逐渐增强。参照《美国药典》的毒性分级法，得到p-HS对PC-12细胞的安全剂量范围为0～1 000 μmol/L，也就是說在该浓度范围内，p-HS单体成分不存在细胞毒性。以上研究说明硫熏天麻药材中的主要硫熏标志物p-HS不会危害人体健康，甚至对人体肝细胞和肾细胞活力表现出一定的促进作用。 4.2 探明了硫熏天麻提取物的细胞毒性 中药汤剂是最为常用的一种制剂形式，在临床应用中也最为广泛[13]。为进一步探讨硫熏中药材水提物的安全性，按照作者前期研究中得到的最佳硫熏工艺（硫磺与药材比为1∶40，熏蒸1 h）对天麻进行硫熏处理后，研究其水提物对人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）、人正常肝细胞（L-02）和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）的细胞活性和毒性的影响。结果显示，硫熏天麻提取物对人体正常HK-2和L-02细胞生长的影响虽然呈现相反的趋势，但整体来看，硫熏处理的药材水提物对人体正常细胞的生长影响不大，与硫熏前差异无统计学意义（P>0.05）。此外，比较硫熏前的，硫熏天麻提取物對非正常PC-12细胞的抑制作用减弱，但整体还是表现出较强的抑制作用。细胞毒性研究发现，在相同浓度下，硫熏后的天麻水提物对HK-2细胞毒性更小，说明硫熏在一定程度上并未对HK-2细胞产生危害。对L-02细胞来说，硫熏前后天麻水提物对L-02细胞毒性的安全剂量范围基本相近，并无明显差异，表明该硫熏工艺条件下，天麻水提物并没有对L-02细胞毒性产生较大影响。另外，硫熏前后天麻提取物对PC-12细胞的安全剂量范围为0～2.5 μg/mL，认为硫熏并没有改变天麻药材提取物对PC-12细胞毒性的安全剂量。
综上所述，按照前期提出的最佳硫熏工艺，在正常的浓度范围内，硫熏天麻提取物不会对HK-2、L-02和PC-12细胞活力产生显著影响。可以说，按照硫磺与药材比为1∶40，熏蒸1 h的硫熏工艺进行熏蒸，在保证药材质量的同时，其硫熏天麻药材提取物对HK-2、L-02和PC-12无明显的细胞毒性，能够较好地保证药材质量安全。
参考文献
[1]冯学译，杨连菊，格小光.中药材使用硫磺熏蒸方法探源[J].湖南中医药大学学报，2007，27（S1）：374.
[2]孙磊，金红宇，马双成，等.中药中二氧化硫残留的检测方法与最大残留限量分析[J].中国药品标准，2012，13（1）：16-19.
[3]赵铮.硫磺熏蒸中药材问题历史文献考察[J].辽宁中医药大学学报，2012，14（10）：154-156.
[4]刘成松，王玉萍，史彦斌，等.硫磺熏蒸党参对小鼠免疫功能的影响[J].中药材，2014，37（11）：1969-1972.
[5]卢晓琳.硫黄熏蒸对白芷化学成分、药效和安全性影响的研究[D].成都：成都中医药大学，2013.
[6]郭婕，周景洋，颜燕，等.硫薰山药对大鼠肝肾代谢功能的影响[J].实验动物科学，2010，27（2）：13-16.
[7]郭婕，赵海霞，颜燕，等.硫磺熏蒸山药对大鼠肝组织抗氧化能力及ATP酶活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：150-153.
[8]Li R，Kou X，Tian J，et al.Effect of sulfur dioxide on inflammatory and immune regulation in asthmatic rats[J].Chemosphere，2014，112：296-304.
[9]张波，刘承芸，孟紫强.二氧化硫对小鼠脑细胞DNA的损伤作用[J].山西大学学报：自然科学版，2003，26（3）：257-259.
[10]Kang C，Lai CJ，Zhao D，et al.A practical protocol for comprehensive evaluation of sulfur-fumigation of Gastrodia Rhizoma using metabolome and health risk assessment analysis[J].J Hazard Mater，2017，340：221-230.
[11]康传志，蒋靖怡，杨婉珍，等.天麻硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite的定量分析及稳定性研究[J].中国中药杂志，2018，43（2）：248-253.
[12]USP XXII，NF XVII[S]，Toxicity classification in US Pharmacopeia，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，1990，2069.
[13]张立双，江丰，赵晨，等.中药汤剂煎煮法的文献调查分析[J].天津中医药，2017，34（6）：422-428.
（2019-10-15收稿 责任编辑：王明）
基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFC1700701）;国家自然科学基金项目（81891014）;财政部中央本级专项（2060302）;国家发改委标准化项目（ZYBZH-C-HLJ-17，ZYBZH-C-GD-07）;现代农业产业技术项目（CARS-21）;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（ZZXT201806）作者简介：康传志（1989.11—），男，博士，助理研究员，研究方向：中药质量评价与生态种植，E-mail：kangchuanzhi1103@163.com通信作者：郭兰萍（1969.08—），女，博士，研究员，研究方向：中药资源生态学，E-mail：glp01@126.com
关键词 天麻;硫熏标志物;p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite;水提物;细胞毒性
Cytotoxicity Evaluation of Sulfur Fumigation Gastrodia Rhizoma Markers and Water Extracts
Kang Chuanzhi，Lyu Chaogeng，Wang Sheng，Wang Tielin，Sun Jiahui，Wang Hongyang，Zhou Li，Guo Lanping
（State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）
Abstract Objective：To evaluate the cytotoxicity of the water extract and p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite in sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma.Methods：The CCK-8 test method was used to investigate the growth of human renal cortical proximal tubular epithelial cells，human normal hepatocytes and rat adrenal pheochromocytoma cells at different doses of sulfur-fumigated markers and water extracts for Gastrodia Rhizoma.And the vitality and cytotoxicity ratings based on relative proliferation rates was also evaluated.Results：The p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite had a good promoting effect on the growth of both human cells，and the toxicity of the United States Pharmacopoeia was used to obtain the marker for rat adrenal pheochromocytoma cells.The safe dose range was from 0 to 1000 μmol/L.In addition，it was found that the water extract of sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma had little effect on the cell viability of normal human cells，and there was no significant difference（P>0.05）before and after of sulfur-fumigating Gastrodia Rhizoma，and the safe dose range of the marker on rat adrenal pheochromocytoma cells was 0～2.5 μg/mL.Conclusion：In the normal concentration range，the p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite and water extract of sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma were not cytotoxic，and had little effect on cell viability.
Key Words Gastrodia Rhizoma; Chemical markers of sulfur fumigation; p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite; Water extract; Cytotoxicity
中图分类号：R282.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.004
硫磺熏蒸（以下简称“硫熏”）加工方法作為传统的中药材养护方法，具有快速干燥、漂白、防霉、防虫和延长贮藏期等作用，已广泛应用到中药材的初加工和仓储等环节[1-3]。当前中药材硫熏滥用现象极为普遍，尤其是在产地加工和贮藏保管等环节。但大量研究已证实硫熏不仅会影响药材质量，残留过量的二氧化硫还会危害人体健康，尤其是药材进入人体后，对肝和肾脏等重要代谢器官的影响较大[4-9]。课题组前期在对硫熏天麻质量评价的研究中发现并获得了硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite（p-HS），作为评价天麻硫熏质量控制的重要评价指标[10-11]，但对该硫熏标志物的安全性问题还不得而知。另外，大部分中药材的服用方式以煎煮为主，因此对硫熏天麻药材煎煮后的提取物进行安全性评价也是很有必要的。 因此，本研究选取了人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）人正常肝细胞（L-02）和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）作为研究评价对象，考察了p-HS标志物和硫熏天麻水提物不同剂量对人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）、人正常肝细胞（L-02）和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）的影响，观察各剂量下HK-2细胞、L-02细胞和PC-12细胞的生长情况，并根据PC-12细胞相对增殖率（Relative Growth Rate，RGR）对硫熏产物p-HS和硫熏药材提取物进行细胞毒性评级，为中药材硫磺熏蒸安全性评价提供参考，也为中药材二氧化硫限量标准的制定提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 二氧化碳培养箱（HERAEUS公司，德国，型号：BB16）;倒置显微镜（Olympus公司，日本，型号：XSZ-D）;全波长酶标仪（thermo公司，芬兰，型号：Multiskan Go-1510）;超低温冰箱（三洋公司，日本，型号：MDF-U5412）;96孔培养板（Corning公司，美国，型号：Corning3599）;台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16C）;电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司，型号：AL104）;电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：DK-98-ⅡA）。
1.2 试剂 CCK-8试剂（碧云天公司，中国，批号：C0038）;DMEM（Gibco BRL公司，美国，批号：12400024）;新生牛血清（杭州四季青生物工程有限公司，批号：22011-8615）;胰蛋白酶（Amresco公司，美国，批号：0785-5G）;二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国，批号：D4540-1L）;注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：H13020657）;注射用硫酸链霉素（大连美罗药厂，批号：H21021674）;PBS（Amresco公司，美国，批号：DZ0231）。
1.3 分析样品 天麻新鲜样品于2017年11月采自贵州省大方县的乌天麻，经中国中医科学院中药资源中心郭兰萍研究员鉴定为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的新鲜块茎，样本存放于中国中医科学院中药资源中心。天麻硫熏标志物p-HS由中国中医科学院中药资源中心分离制备获得[10]。人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2，编号：BNCC338012）;人正常肝细胞（L-02，编号：BNCC100012）;大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12，编号：BNCC 337663），以上3种细胞购于上海宸功生物技术有限公司。
2 方法
2.1 天麻药材硫熏处理方法 取新鲜的天麻样品适量，洗净晾干表面的水分，切成薄片后，分成2组，一组为空白对照组，另外一组按照硫磺与药材用量比1∶40，硫熏1 h的硫熏工艺进行硫熏处理。取出后置于50 ℃烘干，放置于4 ℃保存，备用。
2.2 天麻水提物和p-HS标志物母液制备 天麻p-HS标志物母液配制：取p-HS 1.88 mg（即0.01 mmol）溶于含有1‰ DMSO的10 mL培養液，混匀后于4 ℃冰箱中保存。天麻水提物：分别取硫熏前后的干燥天麻药材100 g，先浸泡30 min，取出后进行煎煮，分2次进行，第1次加10倍量的水，煎煮40 min，第2次加6倍量水，煎煮20 min，滤过，合并滤液，室内减压回收溶剂或冻干得到4份待测样品。其中，天麻（TM）、硫熏天麻（TM-S）水提物的质量分别为20.84 g和17.09 g。根据水提物和药材质量比值，计算得到2份样品的提取率分别为20.32%和16.99%。
2.3 样品剂量设置 天麻p-HS标志物：根据细胞抑制率情况以r=10，设置5个浓度梯度，分别为0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L和1 000 μmol/L，观察细胞生长情况及状态。天麻提取液：根据HK-2和L-02细胞抑制率情况，设置5个浓度梯度，分别为1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL，观察细胞生长情况及状态。根据PC-12细胞的抑制率情况，将浓度梯度设置为0.1 μg/mL，0.5 μg/mL，2.5 μg/mL，12.5 μg/mL，62.5 μg/mL。
2.4 细胞培养方法 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基传代培养，每2～3 d传代1次，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
2.5 CCK-8试验方法 分别将处于对数生长期的HK-2、L-02和PC-12细胞经胰酶消化后，制成细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，边缘孔用无菌PBS填充。置5% CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的p-HS，设置6个浓度梯度，同时设置不加药的阴性平行对照组。每孔100 μL，设6个复孔。培养24 h后避光加入CCK-8溶液10 μL，置培养箱中继续培养2 h。在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光度，计算细胞活力，并将处理组与对照组进行统计分析，重复实验3次。
2.6 细胞相对增殖率（RGR，%）及细胞抑制率（%）的计算 相对增殖率（RGR，%）=（实验组吸光度均值/对照组吸光度均值）×100%;细胞抑制率（%）=1-相对增殖率（%）。
2.7 细胞毒性评级标准 根据RGR值，参照《美国药典》毒性分级法[12]评价细胞毒性，评价标准为：1）RGR值≥100%为0级;2）75%≤RGR值<100%为Ⅰ级;3）50%≤RGR值<75%为Ⅱ级;4）25%≤RGR值<50%为Ⅲ级;5）1%≤RGR值<25%为Ⅳ级;6）0≤RGR值<1%为Ⅴ级。
3 结果 3.1 p-HS对HK-2、L-02和PC-12细胞活性的影响 给予人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）和人正常肝细胞（L-02）不同剂量的p-HS（0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L，1 000 μmol/L）处理后，均可不同程度的促进HK-2和L-02细胞的生长。结果见表1和图1。
CCK-8法检测HK-2和L-02细胞培养液中细胞生长和增殖活性研究显示：与正常对照组比较，p-HS药物对HK-2和L-02细胞均具有不同程度的促进作用，且随剂量浓度的增加促进作用加强，当浓度为100 μmol/L时，细胞增殖率最高分别达到34.14%和32.04%。同时具有浓度依赖关系，但当药物浓度达到1 000 μmol/L时，p-HS对HK-2和L-02细胞的促进作用随即减弱。
给予大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）不同剂量的p-HS均可不同程度的抑制PC-12细胞的生长。CCK-8法检测PC-12细胞培养液中细胞生长和增殖活性研究显示：与正常对照组比较，p-HS药物对PC-12细胞均具有不同程度的毒性作用，且随剂量浓度的增加抑制作用加强，具有浓度依赖关系。
3.2 p-HS对HK-2、L-02和PC-12细胞毒性等级评定 给予不同剂量的p-HS均可不同程度影响HK-2、L-02和PC-12细胞的增殖，本研究计算细胞相对增殖率对p-HS药物进行细胞毒性等级评定。一般来说，RGR>50%为合格，RGR<50%为不合格。
根据评定结果，以PC-12细胞为例。见图1。在所有设置的浓度范围内，正常组的毒性等级为0级，0.1 μmol/L组和1 μmol/L组的细胞毒性等级为Ⅰ级，剩余3组的毒性等级为Ⅱ级。按照RGR>50%的标准，得到p-HS对PC-12细胞的安全剂量范围为0～1 000 μmol/L。另外，按照上述评价方法，p-HS对HK-2和L-02细胞的安全剂量范围同样为0～1 000 μmol/L。综上所述，在合理的使用范围内，p-HS化合物对HK-2、L-02和PC-12细胞的生长是较为安全的。
3.3 天麻水提物对HK-2、L-02和PC-12细胞活性影响 分别给予HK-2、L-02和PC-12 3种细胞不同剂量的TM和TM-S样品处理，结果得到2组样品均可不同程度的抑制HK-2、L-02和PC-12细胞的生长。与正常对照组比较，上述2组样品对HK-2、L-02和PC-12均具有不同程度的抑制作用，且随剂量浓度的增加抑制作用加强，具有浓度依赖关系。见图2A、2C、2E。
比较硫熏前后天麻提取物的细胞活性发现，硫熏后的天麻药材提取物对HK-2细胞的抑制率明显低于硫熏前的，说明硫熏后的天麻药材水提物在一定程度上更有利于HK-2细胞的生长。对于L-02细胞来说，硫熏后的天麻不同剂量的提取物对L-02细胞生长的抑制作用高于硫熏前的样品，但差异无统计学意义（P>0.05），表明硫熏前后的天麻药材水提物在一定浓度范围内对HK-2细胞的抑制作用基本一致。通过对HK-2和L-02细胞活性分析，发现硫熏后的天麻提取物对人体正常HK-2和L-02细胞生长的影响虽然呈现相反的趋势，但整体来看，硫熏处理对人体正常细胞的生长影响不大。
另外，对PC-12细胞培养液中细胞生长和增殖活性研究显示，与正常对照组比较，2组样品对PC-12均具有不同程度的抑制作用，且随剂量浓度的增加促进作用加强。而且，硫熏后的天麻提取物对非正常PC-12细胞的抑制作用减弱，与硫熏前差异无统计学意义（P>0.05），但还是表现出较强的抑制作用。
3.4 天麻水提物对HK-2、L-02和PC-12细胞毒性分析 给予HK-2、L-02和PC-12细胞不同剂量的TM、TM-S、NX、NX-S样品处理，发现2组样品均可不同程度影响HK-2、L-02和PC-12细胞的增殖，且随着浓度增加增殖作用减弱。计算细胞相对增殖率（GRG）对硫熏前后天麻提取物进行细胞毒性等级评定。一般来说，RGR>50%认为安全，即0级、Ⅰ级和Ⅱ级视为安全范围。
对HK-2细胞来说（图2B），TM组的细胞安全剂量范围为0～100 μg/mL，TM-S组的安全剂量范围为0～1 000 μg/mL，说明在相同浓度下，硫熏后的天麻水提物对HK-2细胞毒性更小，安全剂量范围更宽。对L-02细胞来说（图2D），TM组的细胞安全剂量范围为0～1 000 μg/mL，TM-S组的安全剂量范围均为0～100 μg/mL。但从1 000 μg/mL剂量组看，硫熏前后天麻水提物对L-02细胞毒性基本相近，差异无统计学意义。从PC-12细胞来看（图2F），TM和TM-S2组的安全剂量范围均为0～2.5 μg/mL，说明硫熏前后天麻药材提取物对PC-12细胞增殖的影响相对一致。以上表明，硫熏天麻提取物对不同细胞产生的细胞毒性各有差异，既有促进作用，又有抑制作用，但总体上硫熏前后药材提取物对细胞毒性影响差异无统计学意义。
4 结论
4.1 明确了天麻硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite细胞毒性 课题组前期的研究中发现并分离得到了天麻硫熏标志物p-HS，该成分可作为评价天麻硫熏与否的专属性质量控制指标。为了明确该标志物对人体是否具有细胞毒性，文章考察了不同剂量p-HS对人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）、人正常肝细胞（L-02）和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）的活力的影响。分析认为当浓度范围在0～100 μmol/L时，p-HS对HK-2细胞和L-02细胞均具有不同程度的促进作用，且随剂量浓度的增加促进作用加强。当处理浓度达到1 000 μmol/L时，p-HS成分对HK-2和L-02细胞的促进作用随即减弱，但还是对细胞活力表现出促进作用。这在一定程度上说明该成分对于人体的肝细胞和肾细胞生长均表现出良好的促进作用。此外，对PC-12细胞毒性研究发现，p-HS药物对PC-12细胞均具有不同程度的抑制作用，且随剂量浓度的增加抑制作用逐渐增强。参照《美国药典》的毒性分级法，得到p-HS对PC-12细胞的安全剂量范围为0～1 000 μmol/L，也就是說在该浓度范围内，p-HS单体成分不存在细胞毒性。以上研究说明硫熏天麻药材中的主要硫熏标志物p-HS不会危害人体健康，甚至对人体肝细胞和肾细胞活力表现出一定的促进作用。 4.2 探明了硫熏天麻提取物的细胞毒性 中药汤剂是最为常用的一种制剂形式，在临床应用中也最为广泛[13]。为进一步探讨硫熏中药材水提物的安全性，按照作者前期研究中得到的最佳硫熏工艺（硫磺与药材比为1∶40，熏蒸1 h）对天麻进行硫熏处理后，研究其水提物对人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）、人正常肝细胞（L-02）和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）的细胞活性和毒性的影响。结果显示，硫熏天麻提取物对人体正常HK-2和L-02细胞生长的影响虽然呈现相反的趋势，但整体来看，硫熏处理的药材水提物对人体正常细胞的生长影响不大，与硫熏前差异无统计学意义（P>0.05）。此外，比较硫熏前的，硫熏天麻提取物對非正常PC-12细胞的抑制作用减弱，但整体还是表现出较强的抑制作用。细胞毒性研究发现，在相同浓度下，硫熏后的天麻水提物对HK-2细胞毒性更小，说明硫熏在一定程度上并未对HK-2细胞产生危害。对L-02细胞来说，硫熏前后天麻水提物对L-02细胞毒性的安全剂量范围基本相近，并无明显差异，表明该硫熏工艺条件下，天麻水提物并没有对L-02细胞毒性产生较大影响。另外，硫熏前后天麻提取物对PC-12细胞的安全剂量范围为0～2.5 μg/mL，认为硫熏并没有改变天麻药材提取物对PC-12细胞毒性的安全剂量。
综上所述，按照前期提出的最佳硫熏工艺，在正常的浓度范围内，硫熏天麻提取物不会对HK-2、L-02和PC-12细胞活力产生显著影响。可以说，按照硫磺与药材比为1∶40，熏蒸1 h的硫熏工艺进行熏蒸，在保证药材质量的同时，其硫熏天麻药材提取物对HK-2、L-02和PC-12无明显的细胞毒性，能够较好地保证药材质量安全。
参考文献
[1]冯学译，杨连菊，格小光.中药材使用硫磺熏蒸方法探源[J].湖南中医药大学学报，2007，27（S1）：374.
[2]孙磊，金红宇，马双成，等.中药中二氧化硫残留的检测方法与最大残留限量分析[J].中国药品标准，2012，13（1）：16-19.
[3]赵铮.硫磺熏蒸中药材问题历史文献考察[J].辽宁中医药大学学报，2012，14（10）：154-156.
[4]刘成松，王玉萍，史彦斌，等.硫磺熏蒸党参对小鼠免疫功能的影响[J].中药材，2014，37（11）：1969-1972.
[5]卢晓琳.硫黄熏蒸对白芷化学成分、药效和安全性影响的研究[D].成都：成都中医药大学，2013.
[6]郭婕，周景洋，颜燕，等.硫薰山药对大鼠肝肾代谢功能的影响[J].实验动物科学，2010，27（2）：13-16.
[7]郭婕，赵海霞，颜燕，等.硫磺熏蒸山药对大鼠肝组织抗氧化能力及ATP酶活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：150-153.
[8]Li R，Kou X，Tian J，et al.Effect of sulfur dioxide on inflammatory and immune regulation in asthmatic rats[J].Chemosphere，2014，112：296-304.
[9]张波，刘承芸，孟紫强.二氧化硫对小鼠脑细胞DNA的损伤作用[J].山西大学学报：自然科学版，2003，26（3）：257-259.
[10]Kang C，Lai CJ，Zhao D，et al.A practical protocol for comprehensive evaluation of sulfur-fumigation of Gastrodia Rhizoma using metabolome and health risk assessment analysis[J].J Hazard Mater，2017，340：221-230.
[11]康传志，蒋靖怡，杨婉珍，等.天麻硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite的定量分析及稳定性研究[J].中国中药杂志，2018，43（2）：248-253.
[12]USP XXII，NF XVII[S]，Toxicity classification in US Pharmacopeia，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，1990，2069.
[13]张立双，江丰，赵晨，等.中药汤剂煎煮法的文献调查分析[J].天津中医药，2017，34（6）：422-428.
（2019-10-15收稿 责任编辑：王明）
基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFC1700701）;国家自然科学基金项目（81891014）;财政部中央本级专项（2060302）;国家发改委标准化项目（ZYBZH-C-HLJ-17，ZYBZH-C-GD-07）;现代农业产业技术项目（CARS-21）;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（ZZXT201806）作者简介：康传志（1989.11—），男，博士，助理研究员，研究方向：中药质量评价与生态种植，E-mail：kangchuanzhi1103@163.com通信作者：郭兰萍（1969.08—），女，博士，研究员，研究方向：中药资源生态学，E-mail：glp01@126.com