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摘要：研究了不同激素处理、不同花粉发育时期、不同低温预处理和高温预培养对丹参花药愈伤组织诱导的影响。结果表明：最佳的培养基激素组合为Ms+2.O mg／L6-BA+O.2mg／LN从；单核靠边期的花药愈伤组织诱导率最高；4℃低温预处理2d最有助于愈伤组织发生；高温预培养不利于愈伤组织诱导率的提高。
关键词：丹参；花药培养；愈伤组织
中图分类号：$567.530.353 文献标识号：A 文章编号：1001—4942(2010)08—0005—04
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bge.)干燥的根及根茎，主要有效成分为丹参酮IA、丹参酮ⅡA和隐丹参酮等脂溶性二萜类化合物和丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛等酚酸类化合物，为大宗常见中药材，具有活血祛瘀，消肿止痛，养血安神的功效，现代药理表明丹参在治疗冠心病方面有显著的疗效。
随着市场需求的增加，栽培丹参成为中药丹参的主要来源。现在丹参市场存在种质混杂、质量参差不齐的现象，因此，有必要选育产量高、抗病性强、有效成分含量高的优良丹参品种。采用常规育种方法，获得纯系需要3—5年的时间，利用花药培养可诱导单倍体植株，经加倍后可迅速获得纯系，缩短育种年限。
目前在很多作物上开展了花药培养方面的研究，在枸杞、百合、枇杷等中药植物中也开展了研究。有关丹参花药培养方面的研究目前尚未见报道，本研究以丹参花药为试验材料。对影响丹参花药愈伤组织诱导的关键因子进行了初步的探索，为丹参单倍体植株的获得奠定了理论和技术基础。
l 材料与方法
1.1试验材料 2009年5月上中旬，在山东农业大学药用植物园采集一年生丹参未开放花蕾的花序，用醋酸洋红染色，检查花粉发育时期。选用花粉发育处于单核靠边期的花蕾进行培养。
1.2试验方法
晴天午后采集未开放花蕾，4℃低温保存2 d(温度预处理的材料除外)，清水冲洗30 min，75％酒精浸泡30 s，10％次氯酸钠消毒15 min，再用无菌水冲洗3～5遍，无菌条件下剥取花药接种于MS培养基上，接种密度为20个花药／瓶，每处理接种9瓶。MS培养基添加蔗糖30 g／L，琼脂6／L，pH值为5.8～6.0，120～125％下灭菌20min。花药愈伤组织诱导期间进行黑暗培养，温度为(25±1)℃。30 d后调查愈伤组织诱导率。
1.2.1 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响将花药接入不同激素配比的MS固体培养基中，观察不同激素配比对花药愈伤组织诱导的影响。
1.2.2花药不同发育时期对愈伤组织诱导的影响将不同发育时期的花药分别接入MS+2.0m／L 6一BA+0.2 mg／L NAA的固体培养基中，观察不同发育时期对愈伤组织诱导的影响。
1.2.3不同低温预处理对愈伤组织诱导的影响 花蕾采摘后，进行4'E低温预处理O、1、2、3、4d，处理后将花药接入MS+2.0mg/L6一BA+O.2m/L NAA的固体培养基中，观察不同低温预处理时间对愈伤组织诱导的影响。
1.2.4不同高温预培养对愈伤组织诱导的影响 花蕾采摘后直接进行处理，将花药接入MS+2.O m／L 6一BA+0.2 m／LNAA的固体培养基中，放入35℃恒温箱中预培养O、1、2、3、4 d，再置于25℃常温下培养，观察不同高温预培养时间对愈伤组织诱导的影响。
2 结果与分析
2.1 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
以MS为基本培养基，6－BA、2，4－D、NAA为外源激素进行正交试验(见表1)。从表1可以看出，添加激素能显著提高花药培养愈伤组织的诱导率，3种激素的极差大小依次为6一BA>2，4－D>NAA。不同的激素组合和浓度配比，对丹参愈伤组织的诱导效果不同，添加2.0 mg，／L 6－BA+0.2 mg／L NAA的培养基，愈伤组织诱导率最高，达到了84.2％，与其它处理相比，差异显著(P<0.05)，说明2.O mg／L 6一BA+O.2 m／LNAA是丹参花药培养中诱导出愈较好的激素配比。
2.2花药不同发育时期对愈伤组织诱导的影响
从表2可以看出，小孢子处于4个发育时期的花药都能诱导出愈伤组织，以单核靠边期诱导率最高，为75.8％，与其它3个时期诱导率相比，差异显著，因此认为以单核靠边期的花药为外植体进行愈伤组织的诱导较适宜。
2.3 不同低温预处理对愈伤组织诱导的影响
将小孢子发育时期处于单核靠边期的花蕾经过低温(4℃)预处理后，愈伤组织诱导率差异显著(表3)。4℃处理1～2 d，能显著提高愈伤组织的诱导率，处理2 d，诱导率达最高，与未经低温处理及低温处理1 d的差异显著。但随着低温处理时间的延长，诱导率迅速下降，低温处理4 d的诱导率最低。说明小孢子发育处于单核靠边期的花药进行低温预处理的适宜时间是2 d。
2.4不同高温预培养对愈伤组织诱导的影响
将小孢子发育处于单核靠边期的花药接种在诱导培养基上进行35℃高温预培养，发现随高温预培养时间的延长，愈伤组织诱导率下降(表4)。经高温预培养后，花药迅速变褐，转到25"C常温下培养，比不经高温预培养的花药产生愈伤组织慢且长出的愈伤组织呈黄褐色，质地松散。说明高温预培养不利于丹参花药培养愈伤组织出愈率的提高。
3 讨论与结论
外源激素对诱导花粉细胞的增殖和发育起着重要作用，不同作物、基因型及外植体对激素的种类和配比有不同的要求。角豆树添加0.5 mg／L 2，4-D+4 mg／L TDZ愈伤组织诱导效果最好，小叶锦鸡儿添加1.O mg／L 6-BA+3.O m／L 2。4一D组合对愈伤组织形成的效果最好，紫花苜蓿花药诱导愈伤组织最佳的激素组合为O.5mg／L 2，4-D+0.2mg／LNAA+O.5 mg／L 6-BA+3 mg／L KT。本研究表明，添加6-BA、2，4-D、NAA三种激素组合均能诱导出愈伤组织，其中以6-BA作用最显著。研究中发现添加2.O mg／L6-BA+2.O mg／L2，4-D的诱导率较高，但该组合的愈伤组织生长迅速，为白色松散愈伤组织，贴近培养基处有毛状根生长，进行分化培养时愈伤组织不能转绿，仍然保持愈伤组织生长状态，可能2，4－D促进丹参花药愈伤组织细胞分裂作用强烈，致使转接后的愈伤组织中仍保留有较高浓度的2，4－D。本研究表明，添加2.Om／L 6一BA+0.2 mg／L NAA的培养基，愈伤组织诱导率最高，并且在此培养基上长出的愈伤组织颜色淡黄、质地紧密，转到光下进行分化培养时愈伤组织能够迅速转绿，表面生成绿色芽点，绿苗分化率较高。
小孢子发育时期与愈伤组织的诱导存在密切关系。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子时期不同，对大多数植物而言，小孢子发育时期为单核中期至晚期的花药容易形成愈伤组织。黄瓜花药培养愈伤组织诱导率最高的时期是单核中后期。百合花药培养最适宜的时期是单核期。本研究表明丹参花药培养的最佳小孢子发育时期为单核靠边期，进一步证明了单核中期至晚期是大多数植物花药培养诱导出愈的最好时期。
花蕾采集后进行一定时间的低温预处理，既缓解了接种时间，对大多数植物的花药诱导也具有良好的促进作用。但不同的植物，适合的低温预处理时间不同。辣椒花蕾经l～7 d低温预处理后花药愈伤组织诱导率明显高于对照。二倍体马铃薯花蕾在4℃低温预处理48 h后接种花药，可明显提高愈伤组织诱导率。本试验中接种的丹参花药进行低温预处理后，诱导率明显提高，以低温处理2 d诱导率最高，之后，随着低温处理时间的延长，诱导率下降。
花药接种后先进行一定时间的高温预培养，然后转入25℃恒温培养，能够提高花药培养的诱导率，一般以30—35~C处理l-3 d为宣。但丹参花药接种后进行35℃高温预培养1 d后，花药表面变褐，愈伤组织诱导率低于不经高温预培养的处理，且随着处理时间的延长，花药表面褐化加速，愈伤组织诱导率急剧下降。说明不同植物对高温处理的反应不同，高温处理对丹参花药愈伤组织的诱导没有促进作用。
通过对影响丹参花药培养愈伤组织形成的各因子的研究，筛选出了各影响因子的最佳组合：将采摘花蕾经过4℃低温预处理2 d，选取小孢子发育处于单核靠边期的花药为外植体，接种在MS+3％蔗糖+O.6％琼脂+2.O mg／L 6－BA+O.2 mg／L NAA的培养基上，最有利于丹参花药愈伤组织的诱导。
关键词：丹参；花药培养；愈伤组织
中图分类号：$567.530.353 文献标识号：A 文章编号：1001—4942(2010)08—0005—04
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bge.)干燥的根及根茎，主要有效成分为丹参酮IA、丹参酮ⅡA和隐丹参酮等脂溶性二萜类化合物和丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛等酚酸类化合物，为大宗常见中药材，具有活血祛瘀，消肿止痛，养血安神的功效，现代药理表明丹参在治疗冠心病方面有显著的疗效。
随着市场需求的增加，栽培丹参成为中药丹参的主要来源。现在丹参市场存在种质混杂、质量参差不齐的现象，因此，有必要选育产量高、抗病性强、有效成分含量高的优良丹参品种。采用常规育种方法，获得纯系需要3—5年的时间，利用花药培养可诱导单倍体植株，经加倍后可迅速获得纯系，缩短育种年限。
目前在很多作物上开展了花药培养方面的研究，在枸杞、百合、枇杷等中药植物中也开展了研究。有关丹参花药培养方面的研究目前尚未见报道，本研究以丹参花药为试验材料。对影响丹参花药愈伤组织诱导的关键因子进行了初步的探索，为丹参单倍体植株的获得奠定了理论和技术基础。
l 材料与方法
1.1试验材料 2009年5月上中旬，在山东农业大学药用植物园采集一年生丹参未开放花蕾的花序，用醋酸洋红染色，检查花粉发育时期。选用花粉发育处于单核靠边期的花蕾进行培养。
1.2试验方法
晴天午后采集未开放花蕾，4℃低温保存2 d(温度预处理的材料除外)，清水冲洗30 min，75％酒精浸泡30 s，10％次氯酸钠消毒15 min，再用无菌水冲洗3～5遍，无菌条件下剥取花药接种于MS培养基上，接种密度为20个花药／瓶，每处理接种9瓶。MS培养基添加蔗糖30 g／L，琼脂6／L，pH值为5.8～6.0，120～125％下灭菌20min。花药愈伤组织诱导期间进行黑暗培养，温度为(25±1)℃。30 d后调查愈伤组织诱导率。
1.2.1 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响将花药接入不同激素配比的MS固体培养基中，观察不同激素配比对花药愈伤组织诱导的影响。
1.2.2花药不同发育时期对愈伤组织诱导的影响将不同发育时期的花药分别接入MS+2.0m／L 6一BA+0.2 mg／L NAA的固体培养基中，观察不同发育时期对愈伤组织诱导的影响。
1.2.3不同低温预处理对愈伤组织诱导的影响 花蕾采摘后，进行4'E低温预处理O、1、2、3、4d，处理后将花药接入MS+2.0mg/L6一BA+O.2m/L NAA的固体培养基中，观察不同低温预处理时间对愈伤组织诱导的影响。
1.2.4不同高温预培养对愈伤组织诱导的影响 花蕾采摘后直接进行处理，将花药接入MS+2.O m／L 6一BA+0.2 m／LNAA的固体培养基中，放入35℃恒温箱中预培养O、1、2、3、4 d，再置于25℃常温下培养，观察不同高温预培养时间对愈伤组织诱导的影响。
2 结果与分析
2.1 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
以MS为基本培养基，6－BA、2，4－D、NAA为外源激素进行正交试验(见表1)。从表1可以看出，添加激素能显著提高花药培养愈伤组织的诱导率，3种激素的极差大小依次为6一BA>2，4－D>NAA。不同的激素组合和浓度配比，对丹参愈伤组织的诱导效果不同，添加2.0 mg，／L 6－BA+0.2 mg／L NAA的培养基，愈伤组织诱导率最高，达到了84.2％，与其它处理相比，差异显著(P<0.05)，说明2.O mg／L 6一BA+O.2 m／LNAA是丹参花药培养中诱导出愈较好的激素配比。
2.2花药不同发育时期对愈伤组织诱导的影响
从表2可以看出，小孢子处于4个发育时期的花药都能诱导出愈伤组织，以单核靠边期诱导率最高，为75.8％，与其它3个时期诱导率相比，差异显著，因此认为以单核靠边期的花药为外植体进行愈伤组织的诱导较适宜。
2.3 不同低温预处理对愈伤组织诱导的影响
将小孢子发育时期处于单核靠边期的花蕾经过低温(4℃)预处理后，愈伤组织诱导率差异显著(表3)。4℃处理1～2 d，能显著提高愈伤组织的诱导率，处理2 d，诱导率达最高，与未经低温处理及低温处理1 d的差异显著。但随着低温处理时间的延长，诱导率迅速下降，低温处理4 d的诱导率最低。说明小孢子发育处于单核靠边期的花药进行低温预处理的适宜时间是2 d。
2.4不同高温预培养对愈伤组织诱导的影响
将小孢子发育处于单核靠边期的花药接种在诱导培养基上进行35℃高温预培养，发现随高温预培养时间的延长，愈伤组织诱导率下降(表4)。经高温预培养后，花药迅速变褐，转到25"C常温下培养，比不经高温预培养的花药产生愈伤组织慢且长出的愈伤组织呈黄褐色，质地松散。说明高温预培养不利于丹参花药培养愈伤组织出愈率的提高。
3 讨论与结论
外源激素对诱导花粉细胞的增殖和发育起着重要作用，不同作物、基因型及外植体对激素的种类和配比有不同的要求。角豆树添加0.5 mg／L 2，4-D+4 mg／L TDZ愈伤组织诱导效果最好，小叶锦鸡儿添加1.O mg／L 6-BA+3.O m／L 2。4一D组合对愈伤组织形成的效果最好，紫花苜蓿花药诱导愈伤组织最佳的激素组合为O.5mg／L 2，4-D+0.2mg／LNAA+O.5 mg／L 6-BA+3 mg／L KT。本研究表明，添加6-BA、2，4-D、NAA三种激素组合均能诱导出愈伤组织，其中以6-BA作用最显著。研究中发现添加2.O mg／L6-BA+2.O mg／L2，4-D的诱导率较高，但该组合的愈伤组织生长迅速，为白色松散愈伤组织，贴近培养基处有毛状根生长，进行分化培养时愈伤组织不能转绿，仍然保持愈伤组织生长状态，可能2，4－D促进丹参花药愈伤组织细胞分裂作用强烈，致使转接后的愈伤组织中仍保留有较高浓度的2，4－D。本研究表明，添加2.Om／L 6一BA+0.2 mg／L NAA的培养基，愈伤组织诱导率最高，并且在此培养基上长出的愈伤组织颜色淡黄、质地紧密，转到光下进行分化培养时愈伤组织能够迅速转绿，表面生成绿色芽点，绿苗分化率较高。
小孢子发育时期与愈伤组织的诱导存在密切关系。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子时期不同，对大多数植物而言，小孢子发育时期为单核中期至晚期的花药容易形成愈伤组织。黄瓜花药培养愈伤组织诱导率最高的时期是单核中后期。百合花药培养最适宜的时期是单核期。本研究表明丹参花药培养的最佳小孢子发育时期为单核靠边期，进一步证明了单核中期至晚期是大多数植物花药培养诱导出愈的最好时期。
花蕾采集后进行一定时间的低温预处理，既缓解了接种时间，对大多数植物的花药诱导也具有良好的促进作用。但不同的植物，适合的低温预处理时间不同。辣椒花蕾经l～7 d低温预处理后花药愈伤组织诱导率明显高于对照。二倍体马铃薯花蕾在4℃低温预处理48 h后接种花药，可明显提高愈伤组织诱导率。本试验中接种的丹参花药进行低温预处理后，诱导率明显提高，以低温处理2 d诱导率最高，之后，随着低温处理时间的延长，诱导率下降。
花药接种后先进行一定时间的高温预培养，然后转入25℃恒温培养，能够提高花药培养的诱导率，一般以30—35~C处理l-3 d为宣。但丹参花药接种后进行35℃高温预培养1 d后，花药表面变褐，愈伤组织诱导率低于不经高温预培养的处理，且随着处理时间的延长，花药表面褐化加速，愈伤组织诱导率急剧下降。说明不同植物对高温处理的反应不同，高温处理对丹参花药愈伤组织的诱导没有促进作用。
通过对影响丹参花药培养愈伤组织形成的各因子的研究，筛选出了各影响因子的最佳组合：将采摘花蕾经过4℃低温预处理2 d，选取小孢子发育处于单核靠边期的花药为外植体，接种在MS+3％蔗糖+O.6％琼脂+2.O mg／L 6－BA+O.2 mg／L NAA的培养基上，最有利于丹参花药愈伤组织的诱导。