论文部分内容阅读
摘要[目的]建立高效液相色谱法测定乳制品中黄曲霉毒素M1的测定方法。[方法]供试乳制品经提取、净化后用高效液相色谱法测定其中黄曲霉素M1的含量。[结果]黄曲霉毒素M1在2～10 ng/ml范围内线性良好，相关系数r=0.995 9，平均回收率为96.7%，检出限为0.4 μg/kg。[结论]研究所用方法简单准确，稳定性和重现性较好，可用于乳制品中黄曲霉毒素M1含量的测定。
关键词乳制品；黄曲霉毒素M1；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号S879.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-270-02
黄曲霉毒素在1993年被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer）划定为 Ⅰ 类致癌物（明确的人类致癌物）， 是一种毒性极强的剧毒物质，其毒性是氰化钾的10倍，主要表现为致癌、致畸、致突变[1] 。黄曲霉毒素M1对热非常稳定，299 ℃才会被破坏，在一般烹调温度、巴氏杀菌或者高温杀菌条件下几乎都不会被破坏[2]。哺乳动物在摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料或食品后，在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，被羟基化生成的二次毒性代谢产物为黄曲霉毒素M1[3]。黄曲霉毒素M1在进入人体或动物体后，除了抑制DNA、RNA合成外， 也会抑制肝脏蛋白质合成，导致人体中毒[4]。该毒素主要危害的部位在肝脏，其危害主要表现在损害组织器官、引发动物及人类的肝癌、肾癌和胃癌等抑制免疫机能[5]，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍。黄曲霉毒素M1一部分从尿和乳汁中排出， 一部分存在于动物细胞的可食部分如肝、蛋类、 肾、 血和肌肉中， 其中以乳最为常见[6]。牛乳及其制品是易受黄曲霉毒素M1污染的食品之一，对牛奶中黄曲霉毒素M1准确定量（如我国规定牛奶中黄曲霉毒素M1的最大残留限量为0.5 μg/kg[7]），了解真实污染水平，对维护人群健康具有重要意义。
HPLC 法是利用免疫亲和柱或C18柱将样品中的黄曲霉毒素M1 萃取、净化、浓缩、分离，再通过HPLC 串联检测器进行检测[8]。免疫亲和柱是利用抗原抗体的特异性吸附特性， 亲和柱只能特异性、选择性地吸附黄曲霉毒素，而其他杂质则顺利通过柱子， 然后再利用洗脱液将黄曲霉毒素洗脱下来[9]。该方法大大简化了样品的前处理过程， 且利用高效液相色谱法可同时进行定量和定性黄曲霉毒素M1，具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优点，得到广泛的应用[10]。
1 材料与方法
1.1材料供检测样品为某品牌幼儿奶粉。岛津LC20AT高效液相色谱仪，附带RF20A荧光检测器；KQ500超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；离心机，转速7 000 r/min；氮吹仪；黄曲霉毒素M1免疫亲和柱，北京泰乐祺科技有限公司；黄曲霉毒素M1标准溶液，纯度≥98%。
1.2方法
1.2.1色谱条件。色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈+水（25+75）；流速：1.0 ml/min；柱温：40 ℃；荧光检测器：365 nm激发波长、435 nm发射波长；进样体积：10 μl。
1.2.2线性关系。将标准品溶液储备液（浓度：0.5 μg/ml）用10%乙腈适当稀释后制得浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml的标准品溶液，进样分析，结果表明，黄曲霉毒素M1在2～10 ng/ml浓度范围内线性关系良好。线性方程如下：Y=aX + b（a=2.422 222e-003，b=0.710 529 5），R2=0.991 847 5，R=0.995 915 4。
1.2.3 试样前处理。称取混合均匀的奶粉平行样10 g置于250 ml烧杯中，将50 ml已预热到50 ℃的水多次少量加入到乳粉中，搅拌使其溶解，冷却后置于100 ml容量瓶中，多次少量水淋洗转移，定容至刻度，滤纸过滤或4 000 r/min离心15 min，至少收集50 ml乳试样，备用。
将免疫亲和柱连接在50 ml玻璃注射器下，准确量乳试样50 ml加入玻璃注射器，与真空泵相连，控制试样以2～3 ml/min稳定的流速过柱。注入10 ml纯水分淋洗免疫亲和柱。弃去全部流出液，抽干亲和柱。加入4.0 ml色谱级乙腈洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，然后30 ℃氮吹至近干，用水定容至1 ml，供LC测定。
2 结果与分析
2.1工作曲线 配制浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml的黄曲霉毒素M1标准工作液进行分析，标准曲线如图1所示。
图1 黄曲霉毒素M1的标准工作曲线2.2检出限 将标准品溶液储备液适当稀释后制得一系列不同浓度的标准品溶液，进样分析，以信噪比3∶1作为检出限，得出黄曲霉毒素M1的检出限为0.4 μg/kg。
2.3精密度试验 取标准品溶液，连续进样6次，结果表明，黄曲霉毒素M1的RSD为2.60%，精密度良好。
2.4重复性试验 取试样（以乳粉为例），每试样6份平行样，分别照供试品溶液制备项下方法操作，结果表明，黄曲霉毒素M1的RSD为6.0%，重复性良好。
2.5回收率试验 取黄曲霉毒素M1阴性的乳粉10 g，加入浓度为0.5 μg/ml的黄曲霉毒素标准溶液0.04 ml，照供试品溶液制备项下方法依法操作，测定，检测结果见表1。
2.6标准物质测定机国际实验室能力测试结果 取黄曲霉毒素M1阳性的奶粉标准物质5 g（真值为0.6 μg/kg），每试样3份平行样，分别按供试品溶液制备方法操作，测得结果均在允许范围内，与真值相接近。采用此方法参加由辽宁局实验室测量审核，以奶粉为测试样品，结果令人满意。 3讨论
该试验建立了高效液相色谱法测定乳制品中的黄曲霉毒素M1的方法。此方法基于免疫亲和柱对黄曲霉毒素吸附的专一性，利用HPLC的良好分离效果，达到了灵敏、准确的检测效果；同时，此方法简单易行，检测结果稳定性和重现性均较好，适合于大批量样品的检测。
参考文献
[1] 周贻兵，林野，李磊，等.高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1的含量[J].食品研究与开发，2014，35（15）：96-98.
[2] 梁江，宋筱瑜，李凤琴.黄曲霉毒素M1研究进展[J].卫生研究，2013，42（6）：1055-1059.
[3] 王军淋，蔡增轩，任一平.超高效液相色谱-大体积流通池荧光法检测奶及奶制品中的黄曲霉毒素M1[J].浙江大学学报，2013，39（2）：191-196.
[4] 万珊，朱曦，梁利妹，等.牛奶中黄曲霉毒素M1常见检测方法比较[J].湖北畜牧兽医，2013，34（6）：78-80.
[5] 黄亚伟，魏光，王若兰，等.乳品中黄曲霉毒素 M1 检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2014，5（3）：770-775.
[6] 李燕俊.乳与乳制品中黄曲霉毒素M1的检测方法（ 综述）[J].中国食品卫生杂志，1998，10（2）：31-34.
[7] 张春艳，潘国卿，刘来俊，等.反相高效液相色谱法测定乳和乳制品中的黄曲霉毒素M1[J].理化检验—化学分册，2009，45（9）：1032-1034.
[8] APINYA SANGDOKMAI， UMAPORN PIMPITAK， ANUMART BUAKEAW.Production and Characterization of Monoclonal Antibodies Against Aflatoxin M1[C]//International Conference on Environmental， Biomedical and Biotechnology，vol.16.IPCBEE，2011：141-145.
[9] 彭晓俊，庞晋山，邓爱华，等.乳及乳制品中黄曲霉毒素B1、M1测定方法改进[J].分析科学学报，2014，30（2）：251-254.
[10] 郑荣，毛丹，王珂，等.HPLC法测定乳制品中的黄曲霉毒素M1[J].中国食品卫生杂志，2007，19（4）：318-335.
关键词乳制品；黄曲霉毒素M1；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号S879.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-270-02
黄曲霉毒素在1993年被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer）划定为 Ⅰ 类致癌物（明确的人类致癌物）， 是一种毒性极强的剧毒物质，其毒性是氰化钾的10倍，主要表现为致癌、致畸、致突变[1] 。黄曲霉毒素M1对热非常稳定，299 ℃才会被破坏，在一般烹调温度、巴氏杀菌或者高温杀菌条件下几乎都不会被破坏[2]。哺乳动物在摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料或食品后，在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，被羟基化生成的二次毒性代谢产物为黄曲霉毒素M1[3]。黄曲霉毒素M1在进入人体或动物体后，除了抑制DNA、RNA合成外， 也会抑制肝脏蛋白质合成，导致人体中毒[4]。该毒素主要危害的部位在肝脏，其危害主要表现在损害组织器官、引发动物及人类的肝癌、肾癌和胃癌等抑制免疫机能[5]，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍。黄曲霉毒素M1一部分从尿和乳汁中排出， 一部分存在于动物细胞的可食部分如肝、蛋类、 肾、 血和肌肉中， 其中以乳最为常见[6]。牛乳及其制品是易受黄曲霉毒素M1污染的食品之一，对牛奶中黄曲霉毒素M1准确定量（如我国规定牛奶中黄曲霉毒素M1的最大残留限量为0.5 μg/kg[7]），了解真实污染水平，对维护人群健康具有重要意义。
HPLC 法是利用免疫亲和柱或C18柱将样品中的黄曲霉毒素M1 萃取、净化、浓缩、分离，再通过HPLC 串联检测器进行检测[8]。免疫亲和柱是利用抗原抗体的特异性吸附特性， 亲和柱只能特异性、选择性地吸附黄曲霉毒素，而其他杂质则顺利通过柱子， 然后再利用洗脱液将黄曲霉毒素洗脱下来[9]。该方法大大简化了样品的前处理过程， 且利用高效液相色谱法可同时进行定量和定性黄曲霉毒素M1，具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优点，得到广泛的应用[10]。
1 材料与方法
1.1材料供检测样品为某品牌幼儿奶粉。岛津LC20AT高效液相色谱仪，附带RF20A荧光检测器；KQ500超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；离心机，转速7 000 r/min；氮吹仪；黄曲霉毒素M1免疫亲和柱，北京泰乐祺科技有限公司；黄曲霉毒素M1标准溶液，纯度≥98%。
1.2方法
1.2.1色谱条件。色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈+水（25+75）；流速：1.0 ml/min；柱温：40 ℃；荧光检测器：365 nm激发波长、435 nm发射波长；进样体积：10 μl。
1.2.2线性关系。将标准品溶液储备液（浓度：0.5 μg/ml）用10%乙腈适当稀释后制得浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml的标准品溶液，进样分析，结果表明，黄曲霉毒素M1在2～10 ng/ml浓度范围内线性关系良好。线性方程如下：Y=aX + b（a=2.422 222e-003，b=0.710 529 5），R2=0.991 847 5，R=0.995 915 4。
1.2.3 试样前处理。称取混合均匀的奶粉平行样10 g置于250 ml烧杯中，将50 ml已预热到50 ℃的水多次少量加入到乳粉中，搅拌使其溶解，冷却后置于100 ml容量瓶中，多次少量水淋洗转移，定容至刻度，滤纸过滤或4 000 r/min离心15 min，至少收集50 ml乳试样，备用。
将免疫亲和柱连接在50 ml玻璃注射器下，准确量乳试样50 ml加入玻璃注射器，与真空泵相连，控制试样以2～3 ml/min稳定的流速过柱。注入10 ml纯水分淋洗免疫亲和柱。弃去全部流出液，抽干亲和柱。加入4.0 ml色谱级乙腈洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，然后30 ℃氮吹至近干，用水定容至1 ml，供LC测定。
2 结果与分析
2.1工作曲线 配制浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml的黄曲霉毒素M1标准工作液进行分析，标准曲线如图1所示。
图1 黄曲霉毒素M1的标准工作曲线2.2检出限 将标准品溶液储备液适当稀释后制得一系列不同浓度的标准品溶液，进样分析，以信噪比3∶1作为检出限，得出黄曲霉毒素M1的检出限为0.4 μg/kg。
2.3精密度试验 取标准品溶液，连续进样6次，结果表明，黄曲霉毒素M1的RSD为2.60%，精密度良好。
2.4重复性试验 取试样（以乳粉为例），每试样6份平行样，分别照供试品溶液制备项下方法操作，结果表明，黄曲霉毒素M1的RSD为6.0%，重复性良好。
2.5回收率试验 取黄曲霉毒素M1阴性的乳粉10 g，加入浓度为0.5 μg/ml的黄曲霉毒素标准溶液0.04 ml，照供试品溶液制备项下方法依法操作，测定，检测结果见表1。
2.6标准物质测定机国际实验室能力测试结果 取黄曲霉毒素M1阳性的奶粉标准物质5 g（真值为0.6 μg/kg），每试样3份平行样，分别按供试品溶液制备方法操作，测得结果均在允许范围内，与真值相接近。采用此方法参加由辽宁局实验室测量审核，以奶粉为测试样品，结果令人满意。 3讨论
该试验建立了高效液相色谱法测定乳制品中的黄曲霉毒素M1的方法。此方法基于免疫亲和柱对黄曲霉毒素吸附的专一性，利用HPLC的良好分离效果，达到了灵敏、准确的检测效果；同时，此方法简单易行，检测结果稳定性和重现性均较好，适合于大批量样品的检测。
参考文献
[1] 周贻兵，林野，李磊，等.高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1的含量[J].食品研究与开发，2014，35（15）：96-98.
[2] 梁江，宋筱瑜，李凤琴.黄曲霉毒素M1研究进展[J].卫生研究，2013，42（6）：1055-1059.
[3] 王军淋，蔡增轩，任一平.超高效液相色谱-大体积流通池荧光法检测奶及奶制品中的黄曲霉毒素M1[J].浙江大学学报，2013，39（2）：191-196.
[4] 万珊，朱曦，梁利妹，等.牛奶中黄曲霉毒素M1常见检测方法比较[J].湖北畜牧兽医，2013，34（6）：78-80.
[5] 黄亚伟，魏光，王若兰，等.乳品中黄曲霉毒素 M1 检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2014，5（3）：770-775.
[6] 李燕俊.乳与乳制品中黄曲霉毒素M1的检测方法（ 综述）[J].中国食品卫生杂志，1998，10（2）：31-34.
[7] 张春艳，潘国卿，刘来俊，等.反相高效液相色谱法测定乳和乳制品中的黄曲霉毒素M1[J].理化检验—化学分册，2009，45（9）：1032-1034.
[8] APINYA SANGDOKMAI， UMAPORN PIMPITAK， ANUMART BUAKEAW.Production and Characterization of Monoclonal Antibodies Against Aflatoxin M1[C]//International Conference on Environmental， Biomedical and Biotechnology，vol.16.IPCBEE，2011：141-145.
[9] 彭晓俊，庞晋山，邓爱华，等.乳及乳制品中黄曲霉毒素B1、M1测定方法改进[J].分析科学学报，2014，30（2）：251-254.
[10] 郑荣，毛丹，王珂，等.HPLC法测定乳制品中的黄曲霉毒素M1[J].中国食品卫生杂志，2007，19（4）：318-335.