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摘要：利用杂种优势的方式有效提高作物产量和品质的先决条件是全面系统地掌握色素辣椒亲本的遗传背景，包括遗传差异、遗传距离等，从而可预见性地选育高产高抗杂交种。利用240对InDel引物对30份新疆色素辣椒地方材料的基因组DNA进行PCR扩增，利用软件Ntsys2.10对电泳后的多态性条带进行聚类分析。本研究最终检测出23对特异性引物，将参试材料分为3类，有效区分出不同品种资源间基因的内部差异。InDel分子标记技术系统地评价了各资源间的遗传距离和亲缘关系情况，为杂交育种工作中选配亲本提供了一定的理论参考和指导。
关键词：色素辣椒;遗传多样性;InDel分子标记;聚类分析;杂交组合
中图分类号：S641.303 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2021）17-0067-04
辣椒属于茄科（Solanaceae），是全球第三大作物，随着栽培面积的不断扩大，辣椒产业发展速度迅猛，逐渐成为我国最大的蔬菜产业[1-2]。用于工业萃取辣椒红色素的辣椒即色素辣椒，20世纪90年代初，新疆开始大范围、规模化种植色素辣椒，因其红色素含量和产量高且病虫害少而被国际市场青睐，成为新疆“红色产业”重要组成之一[3]。色素辣椒新品种选育的过程包括自交系选择、杂交试配和品种比较试验等，其中，杂种优势利用是色素辣椒新品种选育的重要途径[4]，而试配亲本的亲缘关系是重要指标。传统育种通常依据田间作物的直观表型性状来分析亲缘关系的远近，譬如生产中关键的经济指标———产量，是育种中判断新品种杂种优势的重要标准[5]，属于数量性状遗传，受环境影响大，通过表型性状选择的效率低。分子标记技术可以使育种者在作物幼苗期、DNA层面上了解各个材料的遗传距离和亲缘关系，快速准确地鉴定出遗传差异。
分子标记技术常用于育种工作中对作物资源的遗传多样性及遗传背景、遗传距离的研究。基于全基因组的分子标记在辣椒中已有应用，但利用InDel标记对新疆色素辣椒种质资源遗传分析和聚类研究的报道较少。插入缺失长度多态性（insertiondeletionlengthpolymorphism，InDel）是近缘种或同一物种不同个体间基因组DNA插入或缺失部分核苷酸的现象，即同源的序列相比，某一个位点有插入或缺失部分碱基的情况[6]。InDel标记作为新一代分子标记[7]，在基因组中分布广泛、数量众多，多应用于分子辅助育种、动植物群体遗传分析等相关研究[8-10]。借助InDel分子标记技术分析种质资源的遗传多样性，有助于优异品质性状的改良[11]。本研究采用240对InDel引物对30份地方色素辣椒资源进行遗传多样性分析评价，快速准确地判断材料间的遗传距离，为后续色素辣椒育种中杂交亲本选配及品种遗传改良提供理论依据和指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
参试的30份试验材料（表1）均由巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院特色作物研究室辣椒课题组提供，其中有本课题组培育的品种（新椒29号）、保存的部分高代自交系材料和其他地区收集的材料（共7份），于2020年10月在人工气候室播种育苗，每份材料育苗40株。
1.2 方法
1.2.1 辣椒DNA提取 每份材料随机采集约100mg新鲜嫩叶，置于1.5mL试管中，放入2粒钢珠，经液氮处理后，采用高通量组织研磨器进行破碎研磨。按照天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒（目录号：DP320）步骤提取各材料的基因组DNA。采用核酸检测仪（NanoDrop-1000）及1%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行纯度、浓度检测，采用凝胶成像系统拍照记录，并将提取的DNA原液于-20℃ 冰箱中保存。
1.2.2 PCR扩增 PCR反应体系（总体积10μL）：模板DNA3.5ng/μL、上下游引物0.5μmol/L和2×TaqPCRMix5.0μL。
扩增反应程序：94℃预变性3min;94℃变性30s，不同引物最佳退火温度下退火30s，72℃延伸60s，35个循环;72℃延伸5min;所得产物4℃冰箱保存。
1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶、北京六一电泳仪厂的DYY-12型电泳仪（200V，400mA，100W，60min），银染法显色后在医用胶片观察灯上，观察并用数码相机拍照。
1.2.4 数据处理 对扩增后的条带进行带型统计分析，根据带型构建（0，1）矩阵（0代表无条带，1代表有条带）存入Excel表格中[12-13]。利用Ntsys210软件计算30份地方资源的遗传相似系数，按照非加权配对算数平均法（UPGMA）进行聚类分析[14]，绘制聚类图。
2 结果与分析
2.1 DNA模板的检测
由图1可知，图谱中条带整齐清晰未见拖尾，样品间浓度较为均匀，所提DNA质量测定值D260nm/D280nm的比值位于1.8～2.0，浓度在237～92ng/μL。
结果表明，提取的DNA纯度高并且结构完整，可以稀释一定比例后用于后续InDel-PCR分析。
2.2 InDel引物多态性分析
随机挑选8个色素辣椒基因组DNA组成小群体，对240对InDel引物进行扩增，淘汰效果欠佳、带型不好辨认的引物，筛选出23对引物（表2）。由图2可知，30份材料有特异性条带，特异性检出率为9.58%。由表3可知，共扩增出166条带，多态性带71条，多态性比率为42.8%。
2.3 聚类结果
采用Ntsys2.10软件对扩增的结果进行分析，计算30份色素辣椒材料之间的遗传相似系数。结果表明，各材料之间的遗传相似系数在0.24～1.00间，供试30份色素辣椒种质资源总体表现遗传差异较小，遗传基础狭窄。对30份色素辣椒材料进行UPGMA聚类分析，由图3可知，在遗传相似系数064处将30份地方色素辣椒材料分为3个类群，其中，第一类群包含13份材料，分別为1、10、2、15、16、17、5、6、11、18、41、12、37;第二类群包含8份材料，分别为8、32、20、21、35、22、33、9;第三类群包含9份材料，分别为4、28、36、13、14、34、7、38、19。
关键词：色素辣椒;遗传多样性;InDel分子标记;聚类分析;杂交组合
中图分类号：S641.303 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2021）17-0067-04
辣椒属于茄科（Solanaceae），是全球第三大作物，随着栽培面积的不断扩大，辣椒产业发展速度迅猛，逐渐成为我国最大的蔬菜产业[1-2]。用于工业萃取辣椒红色素的辣椒即色素辣椒，20世纪90年代初，新疆开始大范围、规模化种植色素辣椒，因其红色素含量和产量高且病虫害少而被国际市场青睐，成为新疆“红色产业”重要组成之一[3]。色素辣椒新品种选育的过程包括自交系选择、杂交试配和品种比较试验等，其中，杂种优势利用是色素辣椒新品种选育的重要途径[4]，而试配亲本的亲缘关系是重要指标。传统育种通常依据田间作物的直观表型性状来分析亲缘关系的远近，譬如生产中关键的经济指标———产量，是育种中判断新品种杂种优势的重要标准[5]，属于数量性状遗传，受环境影响大，通过表型性状选择的效率低。分子标记技术可以使育种者在作物幼苗期、DNA层面上了解各个材料的遗传距离和亲缘关系，快速准确地鉴定出遗传差异。
分子标记技术常用于育种工作中对作物资源的遗传多样性及遗传背景、遗传距离的研究。基于全基因组的分子标记在辣椒中已有应用，但利用InDel标记对新疆色素辣椒种质资源遗传分析和聚类研究的报道较少。插入缺失长度多态性（insertiondeletionlengthpolymorphism，InDel）是近缘种或同一物种不同个体间基因组DNA插入或缺失部分核苷酸的现象，即同源的序列相比，某一个位点有插入或缺失部分碱基的情况[6]。InDel标记作为新一代分子标记[7]，在基因组中分布广泛、数量众多，多应用于分子辅助育种、动植物群体遗传分析等相关研究[8-10]。借助InDel分子标记技术分析种质资源的遗传多样性，有助于优异品质性状的改良[11]。本研究采用240对InDel引物对30份地方色素辣椒资源进行遗传多样性分析评价，快速准确地判断材料间的遗传距离，为后续色素辣椒育种中杂交亲本选配及品种遗传改良提供理论依据和指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
参试的30份试验材料（表1）均由巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院特色作物研究室辣椒课题组提供，其中有本课题组培育的品种（新椒29号）、保存的部分高代自交系材料和其他地区收集的材料（共7份），于2020年10月在人工气候室播种育苗，每份材料育苗40株。
1.2 方法
1.2.1 辣椒DNA提取 每份材料随机采集约100mg新鲜嫩叶，置于1.5mL试管中，放入2粒钢珠，经液氮处理后，采用高通量组织研磨器进行破碎研磨。按照天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒（目录号：DP320）步骤提取各材料的基因组DNA。采用核酸检测仪（NanoDrop-1000）及1%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行纯度、浓度检测，采用凝胶成像系统拍照记录，并将提取的DNA原液于-20℃ 冰箱中保存。
1.2.2 PCR扩增 PCR反应体系（总体积10μL）：模板DNA3.5ng/μL、上下游引物0.5μmol/L和2×TaqPCRMix5.0μL。
扩增反应程序：94℃预变性3min;94℃变性30s，不同引物最佳退火温度下退火30s，72℃延伸60s，35个循环;72℃延伸5min;所得产物4℃冰箱保存。
1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶、北京六一电泳仪厂的DYY-12型电泳仪（200V，400mA，100W，60min），银染法显色后在医用胶片观察灯上，观察并用数码相机拍照。
1.2.4 数据处理 对扩增后的条带进行带型统计分析，根据带型构建（0，1）矩阵（0代表无条带，1代表有条带）存入Excel表格中[12-13]。利用Ntsys210软件计算30份地方资源的遗传相似系数，按照非加权配对算数平均法（UPGMA）进行聚类分析[14]，绘制聚类图。
2 结果与分析
2.1 DNA模板的检测
由图1可知，图谱中条带整齐清晰未见拖尾，样品间浓度较为均匀，所提DNA质量测定值D260nm/D280nm的比值位于1.8～2.0，浓度在237～92ng/μL。
结果表明，提取的DNA纯度高并且结构完整，可以稀释一定比例后用于后续InDel-PCR分析。
2.2 InDel引物多态性分析
随机挑选8个色素辣椒基因组DNA组成小群体，对240对InDel引物进行扩增，淘汰效果欠佳、带型不好辨认的引物，筛选出23对引物（表2）。由图2可知，30份材料有特异性条带，特异性检出率为9.58%。由表3可知，共扩增出166条带，多态性带71条，多态性比率为42.8%。
2.3 聚类结果
采用Ntsys2.10软件对扩增的结果进行分析，计算30份色素辣椒材料之间的遗传相似系数。结果表明，各材料之间的遗传相似系数在0.24～1.00间，供试30份色素辣椒种质资源总体表现遗传差异较小，遗传基础狭窄。对30份色素辣椒材料进行UPGMA聚类分析，由图3可知，在遗传相似系数064处将30份地方色素辣椒材料分为3个类群，其中，第一类群包含13份材料，分別为1、10、2、15、16、17、5、6、11、18、41、12、37;第二类群包含8份材料，分别为8、32、20、21、35、22、33、9;第三类群包含9份材料，分别为4、28、36、13、14、34、7、38、19。