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【摘要】 目的：了解南京市2010-2014年流感流行趋势及病毒株变化，为流感防控提供科学依据。方法：对2010-2014年南京市3家流感哨点医院流感样病例用实时荧光定量PCR检测进行核酸检测，核酸阳性标本采用MDCK细胞进行病毒分离培养，对流感毒株型别、年龄段及性别分布等特征进行比较。结果：2010-2014年共采集流感样病例9823例。其中核酸阳性病例1277例，阳性率13.00%。其中A型各亚型共874例，B型各亚型共403例。男女阳性标本比例1.15∶1，两者阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。25岁～年龄段流感样病例数最高。结论：监测结果提示流感流行包括多种型别流感病毒交替和混合流行，不同年份不同季节呈现一种或多种不同优势株，每年基本有两个流行高峰，即冬春季和夏季高峰。
【关键词】 流感病毒； 流感样病例； 监测
Analysis of Influenza Epidemiological Characteristics in Nanjing， 2011-2014/WANG Yan，SHI Li-min，HE Min，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（36）：065-068
【Abstract】 Objective： To analyze the epidemiological characteristics of influenza in Nanjing City from 2010 to 2014 and provide scientific basis for prevention and control of influenza. Method： RT-PCR were conducted to detect influenza nucleic acid detection of influenza-like Illness and the positive specimens were incubated with MDCK cells to culture and isolate virus from 2011 to 2014 in nanjing in three influenza sentinel hospital. The type and age and gender distribution characteristics were compared. Result： A total of 9823 Nasal swabs were collected from 2011 to 2014，of which 1277 were influenza positive， with a detection rate of 13.00%.The cases of type A were 874， type B were 403. Specimens of men’s and women’s positive ratio was 1.15∶1， the positive difference had no statistical significance （P> 0.05）. Conclusion： Many kinds of flu virus are in popular alternately. The predominant strain vary with season. Every year the incidence peaks of influenza are in summer and winter.
【Key words】 Influenza virus； Influenza-like illness； Monitoring
First-author’s address：NanJing Center for Disease Prevention and Control， Nanjing 210003， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.022
流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒根据核蛋白（NP）和膜蛋白（MP）抗原特性和基因特征，分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型，病毒的分类反映其流行特征及对人类的危害程度，甲型流感病毒常引起世界性的大流行，乙型常引起局部暴发，丙型主要以散在形式出现[1]。流感因其传染性、波及面广，蔓延迅速，是第一个实行全球监测性的传染病[2]。加强流感监测及时发现流感病毒优势毒株的变化及病毒的变异情况，为及时掌握流感的活动情况，明确流行株并及早发现变异株，为季节性流感的流行及流感大流行的预警提供参考依据，是流感防控和流感大流行应对的一项重要措施，还能够为推荐流感疫苗组分提供科学依据[3]。
本文通过分析南京2011-2014年流感监测资料，了解流感流行趋势及其病毒株变化特点，为本地区的流行性感冒防控提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 监测哨点医院及监测对象为南京市儿童医院、南京市鼓楼医院及南京市第一人民医院，其均为本市国家级流感监测哨点医院。哨点医院对发热38 ℃以上，伴咳嗽或咽痛之一，未服用过抗病毒药物，发病3 d内患者采集鼻咽拭子，48 h内送至流感网络实验室进行标本检测。
1.2 核酸提取 取200 μL鼻咽拭子标本加入台塑生医全自动提取试剂盒，按照台塑生医全自动核酸抽提程序对标本进行RNA核酸提取。
1.3 PCR扩增 按照试剂盒说明配置甲型流感病毒通用型、乙型流感病毒Victoria 系、乙型流感病毒Yamagata系、甲型流感病毒季节性H1、甲型流感病毒季节性H3、甲型流感病毒H1N1 PCR 扩增体系，按照试剂说明设置扩增条件，用ABI Prism7500型荧光定量PCR仪扩增反应。结果判断和分析按照试剂盒判断标准。 1.4 病毒分离培养与鉴定 对流感病毒核酸检测阳性的标本进行MDCK 细胞分离培养，MDCK细胞由国家流感中心提供。细胞培养收获液用1%人红细胞进行红细胞凝集试验，HA效价大于等于1∶16的阳性分离物采用流感病毒标准抗血清进行血凝试验鉴定毒株型别，并提取核酸进行PCR扩增。
1.5 统计学处理 采用PEMS 3.1统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 流感样病例核酸检测结果 2011-2014年本中心4个流感监测年度共采集流感样病例鼻咽拭子标本9823例，报告流行性感冒病例1277份，阳性率13.00%。其中2011年共采集流感样病例鼻咽拭子标本1714份，阳性数195份，阳性率11.38%；2012年采集标本1623份，报告阳性数病例332份，阳性率20.46%；2013年采集标本3034份，报告阳性数211份，阳性率6.95%。2014年采集标本3452份，报告阳性数539份，阳性率15.61%。其中2012年阳性率最高，为20.46%。2011年以B型和A型H1N1为主，2012年A型H3N2和B型为主要流行型别，2013年A型H3N2是优势株，有少量B型和混合感染病例，2014年A型H1N1和H3N2，以及B型的By均出现较多病例，见表1。
2.2 季节流行特征 2011-2012流感样病例数相当，2013年4月-2014年哨点医院采集到的流感样病例数显著增加（图1）。2011-2014流感监测年度流感病毒毒株以H1N1型、H3N2型、B型相互交替、混合流行为主。2011年监测年度起始均以H1N1型流感为主，在2011年3月后B型逐渐取代H1N1型成为优势株，持续至年末。2012年始仍以B型为流行株，至3-5月出现B型和H3N2混合流行，从5月至年末均为H3N2型流行。次年出现B型、H1N1和H3N2混合流行状态，至2014年夏季后又转为H3N2为优势株（图2）。
月份
图1 2011-2014年各月份流感样病例监测数
2.3 性别构成 2011-2014年4个流感监测年度共监测流行性感冒病例男性5095例，女性4728例，男女比例1.08∶1。其中2011年男性853例、女性861例，
2012年男性867例、女性756例，2013年男性1569例、女性1465例，2014年男性1806例、女性1646例。流感咽拭子阳性患者共1277例，其中男性686例，阳性率13.46%，女性591例，阳性率12.50%，男女比例1.15∶1，两者比较差异无统计学意义（ 字2=1.72，P>0.05）。
月份
图2 2011-2014年各月份不同分型流感病例数
2.4 各年龄组流感病毒监测 根据年龄的不同，流感样病例被分成0岁～、5岁～、15岁～、25岁～以及≥60岁5个组，25岁～年龄组流感样病例数最多，占总流感样病例数的37.01%，其中2011年占36.64%，2012年占37.77%，2013年占36.42%，2014年占37.35%。60岁～流感样病例数最少，占总流感样病例数的7.50%，其中2011年占5.95%，2012年占6.47%，2013年占8.24%，2014年占8.09%。各组流感病毒的阳性分离率分别为2.84%、5.70%、2.76%、3.19%、4.21%。
2.5 MDCK细胞分离培养结果 将PCR阳性的标本接种于MDCK 细胞，进行流感病毒分离培养，细胞培养收获液用1%人红细胞进行红细胞凝集试验，HA效价大于等于1∶16的阳性分离物用流感病毒标准抗血清进行血凝抑制试验鉴定毒株型别，并提取核酸进行PCR扩增。2011年共分离鉴定阳性毒株33株，分别为H1N 11株、H3N 23株、 Bv 10株、 By 19株。2012共分离鉴定阳性毒株168株，分别为H3N2 88株、 Bv 5株、 By 75株。2013年共分离鉴定阳性毒株45株，分别为H1N 14株、 H3N2 40株、 By 1株。2014共分离鉴定阳性毒株46株，分别为H3N 28株、 Bv 18株。
3 讨论
流感病毒的活动强度与季节关系密切，北方地区流感流行高峰主要在冬季，南方四季都有发生，夏季和冬季达到高峰。2011-2014年流感样病例监测结果显示， 南京市流感流行主要有以下特点：引起南京市2011年流感毒株的流行主要有新甲H1N1及B型，随着时间变迁呈现不同的优势毒株趋势，1月份，主要流行新甲H1N1，2月份B型和H1N1混合流行，5-12月流行的是B型；2012年优势株的主要是H3N2及B型，其中3-5月份，主要B和H3N2混合流行，6-11月份，优势株是H3N2；2013年出现H1N1、H3N2及B型混合流行状态，不同时期呈现不同的优势毒株趋势，直至2014年8月H3N2再次成为唯一的流行株，2014年年末又出现H3N2及B型混合流行状态。图2结果显示流感病毒每年基本有2个流行高峰，即冬春季和夏季高峰，与文献[4]报道我国南方地区流感全年流行情况相符合。一般来说，夏季主要为A型流行，2012年度和2014年表现尤为明显，与文献[5]报道在雨水丰沛的夏季适合甲型流感病毒的存活和传播相符合。从病原学监测结果来看，南京市各年份流行的毒株型别及其流行的时间分布江苏省基本一致[6-9]。
流感病毒常表现为交替或混合流行，2011年度从流感样病例人群中同时分离到A型和B型流感病毒，有A型H1N1、H3N2及B型，流行优势毒株为B 型和H1N1。2012-2013年度从流感样病例人群中也同时分离到A型和B型流感病毒，2012年的优势株为H3N2及B型，2013年则主要为H3N2。自2009年出现H1N1大流行，至2012-2013年年头甲型H1N1毒株逐渐消失，分析原因可能与接种甲流疫苗及患者体内产生甲型H1N1流感抗体有关。2014年出现H1N1、H3N2及B（Yamagata系）混合流行特征，3型均出现较多病例。2011年度有13例A型阳性未能分出亚型病例，原因可能为弱毒株或其他本实验室不具备检测能力的亚型。2013-2014年度各出现7例混合感染病例，均为A型亚型混合感染病例，过去人群中流感病毒各亚型混合感染的报道较少，流感病毒的混合感染现象未引起足够关注，而流感病毒尤其是甲型流感病毒易发生抗原变异，两种或两种以上甲型流感病毒同时感染同一细胞时易发生基因重组，形成新的亚型，由于人群缺乏免疫力引起流行或大流行，故近年来有较多关于流感病毒混合感染的研究[10-13]。 2011-2014年流感样病例男女采样比例相当，除2011年女性略高于男性外，其他几个年份均为男性采样数高于女性。男女阳性标本比例1.15∶1，两者阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。
本文对5个年龄段的流感样病例数以及阳性数的统计结果显示25岁～年龄段流感样病例数最高，其次为0岁～年龄段，≥60岁年龄段病例数最低。25岁～年龄段流感样病例数最高可能原因为其活动范围广，流感病毒流行期间有较多时间处于人群聚集的公共场所，出现症状后及时就诊比例高。0岁～年龄段由于免疫系统尚未发育完善，体内无抗体或抗体水平低以及出现症状后较高的就诊率等原因，流感样病例数居年龄组第2位。
流感病毒分离阳性率与样本处理方法、 分离方法、细胞对病毒的敏感性、细胞状态及标本采集、保存及运送各个环节密切相关，所以确保从标本采集到病毒分离鉴定的每一个环节符合相关要求是分离鉴定成功的关键。在确保操作规范、培养条件良好以及细胞生长状态和敏感性良好的前提下，病毒的分离效率与流感流行的强度相一致，流行强度增加时，毒株的分离率就增高，反之分离率则降低[14]。2011年本实验室共分离鉴定阳性毒株33株，分离率2.07%；2012共分离鉴定阳性毒株168株，分离率31.23%；2013年共分离鉴定阳性毒株45株，分离率10.67%；2014共分离鉴定阳性毒株46株，分离率8.53%。分别与当年采样阳性率和流行强度基本一致。
流感最有效的预防途径就是接种疫苗，而流感抗原基因变异幅度大，由于人群缺乏对新病毒变异株的免疫力，从而引起流感流行，因此每年针对流感病毒都要接种新的流感疫苗，以获得有效保护[15]，加强流感监测、及早发现分析流感流行毒株变化，及时接种有针对性的流感疫苗是降低季节性流感发病率重要措施之一，对流感疫情的防控具有重要意义。
参考文献
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（收稿日期：2015-09-09） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 流感病毒； 流感样病例； 监测
Analysis of Influenza Epidemiological Characteristics in Nanjing， 2011-2014/WANG Yan，SHI Li-min，HE Min，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（36）：065-068
【Abstract】 Objective： To analyze the epidemiological characteristics of influenza in Nanjing City from 2010 to 2014 and provide scientific basis for prevention and control of influenza. Method： RT-PCR were conducted to detect influenza nucleic acid detection of influenza-like Illness and the positive specimens were incubated with MDCK cells to culture and isolate virus from 2011 to 2014 in nanjing in three influenza sentinel hospital. The type and age and gender distribution characteristics were compared. Result： A total of 9823 Nasal swabs were collected from 2011 to 2014，of which 1277 were influenza positive， with a detection rate of 13.00%.The cases of type A were 874， type B were 403. Specimens of men’s and women’s positive ratio was 1.15∶1， the positive difference had no statistical significance （P> 0.05）. Conclusion： Many kinds of flu virus are in popular alternately. The predominant strain vary with season. Every year the incidence peaks of influenza are in summer and winter.
【Key words】 Influenza virus； Influenza-like illness； Monitoring
First-author’s address：NanJing Center for Disease Prevention and Control， Nanjing 210003， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.022
流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒根据核蛋白（NP）和膜蛋白（MP）抗原特性和基因特征，分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型，病毒的分类反映其流行特征及对人类的危害程度，甲型流感病毒常引起世界性的大流行，乙型常引起局部暴发，丙型主要以散在形式出现[1]。流感因其传染性、波及面广，蔓延迅速，是第一个实行全球监测性的传染病[2]。加强流感监测及时发现流感病毒优势毒株的变化及病毒的变异情况，为及时掌握流感的活动情况，明确流行株并及早发现变异株，为季节性流感的流行及流感大流行的预警提供参考依据，是流感防控和流感大流行应对的一项重要措施，还能够为推荐流感疫苗组分提供科学依据[3]。
本文通过分析南京2011-2014年流感监测资料，了解流感流行趋势及其病毒株变化特点，为本地区的流行性感冒防控提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 监测哨点医院及监测对象为南京市儿童医院、南京市鼓楼医院及南京市第一人民医院，其均为本市国家级流感监测哨点医院。哨点医院对发热38 ℃以上，伴咳嗽或咽痛之一，未服用过抗病毒药物，发病3 d内患者采集鼻咽拭子，48 h内送至流感网络实验室进行标本检测。
1.2 核酸提取 取200 μL鼻咽拭子标本加入台塑生医全自动提取试剂盒，按照台塑生医全自动核酸抽提程序对标本进行RNA核酸提取。
1.3 PCR扩增 按照试剂盒说明配置甲型流感病毒通用型、乙型流感病毒Victoria 系、乙型流感病毒Yamagata系、甲型流感病毒季节性H1、甲型流感病毒季节性H3、甲型流感病毒H1N1 PCR 扩增体系，按照试剂说明设置扩增条件，用ABI Prism7500型荧光定量PCR仪扩增反应。结果判断和分析按照试剂盒判断标准。 1.4 病毒分离培养与鉴定 对流感病毒核酸检测阳性的标本进行MDCK 细胞分离培养，MDCK细胞由国家流感中心提供。细胞培养收获液用1%人红细胞进行红细胞凝集试验，HA效价大于等于1∶16的阳性分离物采用流感病毒标准抗血清进行血凝试验鉴定毒株型别，并提取核酸进行PCR扩增。
1.5 统计学处理 采用PEMS 3.1统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 流感样病例核酸检测结果 2011-2014年本中心4个流感监测年度共采集流感样病例鼻咽拭子标本9823例，报告流行性感冒病例1277份，阳性率13.00%。其中2011年共采集流感样病例鼻咽拭子标本1714份，阳性数195份，阳性率11.38%；2012年采集标本1623份，报告阳性数病例332份，阳性率20.46%；2013年采集标本3034份，报告阳性数211份，阳性率6.95%。2014年采集标本3452份，报告阳性数539份，阳性率15.61%。其中2012年阳性率最高，为20.46%。2011年以B型和A型H1N1为主，2012年A型H3N2和B型为主要流行型别，2013年A型H3N2是优势株，有少量B型和混合感染病例，2014年A型H1N1和H3N2，以及B型的By均出现较多病例，见表1。
2.2 季节流行特征 2011-2012流感样病例数相当，2013年4月-2014年哨点医院采集到的流感样病例数显著增加（图1）。2011-2014流感监测年度流感病毒毒株以H1N1型、H3N2型、B型相互交替、混合流行为主。2011年监测年度起始均以H1N1型流感为主，在2011年3月后B型逐渐取代H1N1型成为优势株，持续至年末。2012年始仍以B型为流行株，至3-5月出现B型和H3N2混合流行，从5月至年末均为H3N2型流行。次年出现B型、H1N1和H3N2混合流行状态，至2014年夏季后又转为H3N2为优势株（图2）。
月份
图1 2011-2014年各月份流感样病例监测数
2.3 性别构成 2011-2014年4个流感监测年度共监测流行性感冒病例男性5095例，女性4728例，男女比例1.08∶1。其中2011年男性853例、女性861例，
2012年男性867例、女性756例，2013年男性1569例、女性1465例，2014年男性1806例、女性1646例。流感咽拭子阳性患者共1277例，其中男性686例，阳性率13.46%，女性591例，阳性率12.50%，男女比例1.15∶1，两者比较差异无统计学意义（ 字2=1.72，P>0.05）。
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图2 2011-2014年各月份不同分型流感病例数
2.4 各年龄组流感病毒监测 根据年龄的不同，流感样病例被分成0岁～、5岁～、15岁～、25岁～以及≥60岁5个组，25岁～年龄组流感样病例数最多，占总流感样病例数的37.01%，其中2011年占36.64%，2012年占37.77%，2013年占36.42%，2014年占37.35%。60岁～流感样病例数最少，占总流感样病例数的7.50%，其中2011年占5.95%，2012年占6.47%，2013年占8.24%，2014年占8.09%。各组流感病毒的阳性分离率分别为2.84%、5.70%、2.76%、3.19%、4.21%。
2.5 MDCK细胞分离培养结果 将PCR阳性的标本接种于MDCK 细胞，进行流感病毒分离培养，细胞培养收获液用1%人红细胞进行红细胞凝集试验，HA效价大于等于1∶16的阳性分离物用流感病毒标准抗血清进行血凝抑制试验鉴定毒株型别，并提取核酸进行PCR扩增。2011年共分离鉴定阳性毒株33株，分别为H1N 11株、H3N 23株、 Bv 10株、 By 19株。2012共分离鉴定阳性毒株168株，分别为H3N2 88株、 Bv 5株、 By 75株。2013年共分离鉴定阳性毒株45株，分别为H1N 14株、 H3N2 40株、 By 1株。2014共分离鉴定阳性毒株46株，分别为H3N 28株、 Bv 18株。
3 讨论
流感病毒的活动强度与季节关系密切，北方地区流感流行高峰主要在冬季，南方四季都有发生，夏季和冬季达到高峰。2011-2014年流感样病例监测结果显示， 南京市流感流行主要有以下特点：引起南京市2011年流感毒株的流行主要有新甲H1N1及B型，随着时间变迁呈现不同的优势毒株趋势，1月份，主要流行新甲H1N1，2月份B型和H1N1混合流行，5-12月流行的是B型；2012年优势株的主要是H3N2及B型，其中3-5月份，主要B和H3N2混合流行，6-11月份，优势株是H3N2；2013年出现H1N1、H3N2及B型混合流行状态，不同时期呈现不同的优势毒株趋势，直至2014年8月H3N2再次成为唯一的流行株，2014年年末又出现H3N2及B型混合流行状态。图2结果显示流感病毒每年基本有2个流行高峰，即冬春季和夏季高峰，与文献[4]报道我国南方地区流感全年流行情况相符合。一般来说，夏季主要为A型流行，2012年度和2014年表现尤为明显，与文献[5]报道在雨水丰沛的夏季适合甲型流感病毒的存活和传播相符合。从病原学监测结果来看，南京市各年份流行的毒株型别及其流行的时间分布江苏省基本一致[6-9]。
流感病毒常表现为交替或混合流行，2011年度从流感样病例人群中同时分离到A型和B型流感病毒，有A型H1N1、H3N2及B型，流行优势毒株为B 型和H1N1。2012-2013年度从流感样病例人群中也同时分离到A型和B型流感病毒，2012年的优势株为H3N2及B型，2013年则主要为H3N2。自2009年出现H1N1大流行，至2012-2013年年头甲型H1N1毒株逐渐消失，分析原因可能与接种甲流疫苗及患者体内产生甲型H1N1流感抗体有关。2014年出现H1N1、H3N2及B（Yamagata系）混合流行特征，3型均出现较多病例。2011年度有13例A型阳性未能分出亚型病例，原因可能为弱毒株或其他本实验室不具备检测能力的亚型。2013-2014年度各出现7例混合感染病例，均为A型亚型混合感染病例，过去人群中流感病毒各亚型混合感染的报道较少，流感病毒的混合感染现象未引起足够关注，而流感病毒尤其是甲型流感病毒易发生抗原变异，两种或两种以上甲型流感病毒同时感染同一细胞时易发生基因重组，形成新的亚型，由于人群缺乏免疫力引起流行或大流行，故近年来有较多关于流感病毒混合感染的研究[10-13]。 2011-2014年流感样病例男女采样比例相当，除2011年女性略高于男性外，其他几个年份均为男性采样数高于女性。男女阳性标本比例1.15∶1，两者阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。
本文对5个年龄段的流感样病例数以及阳性数的统计结果显示25岁～年龄段流感样病例数最高，其次为0岁～年龄段，≥60岁年龄段病例数最低。25岁～年龄段流感样病例数最高可能原因为其活动范围广，流感病毒流行期间有较多时间处于人群聚集的公共场所，出现症状后及时就诊比例高。0岁～年龄段由于免疫系统尚未发育完善，体内无抗体或抗体水平低以及出现症状后较高的就诊率等原因，流感样病例数居年龄组第2位。
流感病毒分离阳性率与样本处理方法、 分离方法、细胞对病毒的敏感性、细胞状态及标本采集、保存及运送各个环节密切相关，所以确保从标本采集到病毒分离鉴定的每一个环节符合相关要求是分离鉴定成功的关键。在确保操作规范、培养条件良好以及细胞生长状态和敏感性良好的前提下，病毒的分离效率与流感流行的强度相一致，流行强度增加时，毒株的分离率就增高，反之分离率则降低[14]。2011年本实验室共分离鉴定阳性毒株33株，分离率2.07%；2012共分离鉴定阳性毒株168株，分离率31.23%；2013年共分离鉴定阳性毒株45株，分离率10.67%；2014共分离鉴定阳性毒株46株，分离率8.53%。分别与当年采样阳性率和流行强度基本一致。
流感最有效的预防途径就是接种疫苗，而流感抗原基因变异幅度大，由于人群缺乏对新病毒变异株的免疫力，从而引起流感流行，因此每年针对流感病毒都要接种新的流感疫苗，以获得有效保护[15]，加强流感监测、及早发现分析流感流行毒株变化，及时接种有针对性的流感疫苗是降低季节性流感发病率重要措施之一，对流感疫情的防控具有重要意义。
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（收稿日期：2015-09-09） （本文编辑：蔡元元）