背景:抗氧化剂法及细胞因子法是体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元的2种方法,怎样选择既可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,应用中药干预脐血间充质干细胞的体外纯化、扩增并向神经元细胞分化。目的:观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用。设计,时间,地点:随机对照,细胞学体外观察,于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成。材料:年龄为23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份;黄芩苷,纯度>95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供;抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品。方法:采集胎儿脐带血,肝素抗凝,分离出脐血单个核细胞,调整细胞浓度为1×109L-1,以含体积分数为20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子的DMEM液体培养基进行纯化和扩增。按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷;空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇;共培养组添加黄芩苷、β-巯基乙醇。连续培养4周。主要观察指标:①脐血冷冻保存后7,14,21,28dCD34及CD29阳性细胞的表达。②细胞形态学观察。③流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志。④免疫细胞化学染色观察间充质干细胞扩增培养4周后神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达。结果:①与冻存前相比,冻存后7,14,21,28d脐血单个核细胞锥虫蓝拒染率均明显降低(P<0.05)。②细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2～3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形。4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起。β-巯基乙醇组、共培养组有少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势。③培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组最多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组最少,组间两两比较差异具有显著性意义(P<0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34阳性细胞。④扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P<0.01)。各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%。结论:100μmol/L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化。