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[摘要]目的：通过观察人脐血内皮祖细胞(EPC)在裸鼠体内缺氧状态下分化成内皮细胞的现象，初步研究其促进血管重建的作用。方法：根据EPC表面标记CDl33，采用免疫磁珠法分离培养EPC。设计EPC裸鼠成瘤实验，观察瘤体内血管增生情况；将荧光标记的EPC注射于裸鼠腹部皮辦中，观察EPC参与皮辦血管重建情况；将EPC接种于聚羟基乙酸(PGA)中，移植于裸鼠皮下，观察EPC参与血管重建。结果：原代EPC贴壁后呈梭形，从第7天开始数量明显增加，呈克隆状生长。透射电镜观察到成熟内皮细胞最具特征性的细胞器——Weibel－—Palade小体。裸鼠成瘤实验：抗人vWF免疫荧光显示大量EPC参与肿瘤血管生成；裸鼠皮辦实验：荧光标记EPC参与裸鼠皮辦血管生成；PGA移植实验：抗人vWF免疫酶组织化学染色显示EPC参与血管生成。结论：EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。
[关键词]血管内皮祖细胞；CD133(AC133)：免疫磁珠
[中图分类号]Q254 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0015－04
一般认为内皮祖细胞(endothelial progenitor Cell，EPC)仅见于胚胎时期，但近年来，越来越多的证据表明在成年个体中也存在少量的EPC。1997年ASahara等报道在成人外周血中分离出EPC，体外培养呈梭形，具有形成管腔样结构的能力，且能够表达成熟内皮细胞的特异性抗原，在动物实验中可参与新生血管的形成，此后，又陆续观察到骨髓和脐带血中均存在EPC。EPC具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。本实验采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养EPC，观察EPC在体内缺氧条件下分化成内皮细胞，并参与血管生成，为治疗性血管发生研究及组织器官移植提供种子细胞。
1 材料和方法
1．1主要试剂及标本来源：胃癌GC7901细胞株由第四军医大学实验动物研究中心细胞库提供)；ACD—B抗凝液(上海市血液中心)：1．077淋巴细胞分离液(天津TBD公司)；免疫磁珠试剂盒(挪威DYNAL公司)；Fibronectin(美国Sigma公司)：异硫氰酸荧光素(FITC)CDl33单抗(美国R&D公司)；抗人vWF单抗(英国Serotec公司)；F1RC－二抗及辣根过氧化物酶标记二抗、CD34单抗(丹麦DAKO公司)；EGM-2MV培养基(美国Cambrex公司)；细胞荧光染色试剂盒(PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit，Sigma，美国)；人纤维蛋白原(Fibronogen，Sigma，美国)：人凝血酶(Thrombin 500，IMMUNO AG，奥地利)：PGA真皮替代物(NEOVEIL，日本)。BALB／c，nu／lnu裸小鼠15只，雌雄不限，鼠龄4～6周，体重18～23g(第四军医大学实验动物研究中心)；人脐血标本来源于本院34例妇产科健康产妇(产妇均知情同意)。
1．2 EPC分离及诱导分化培养：ACD-B抗凝脐血，1：2加入磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，取7ml缓慢加入3ml淋巴细胞分离液，621×g离心30min，取单个核细胞层，PBS洗涤3次去血小板。免疫磁珠与FITC-CDl33单抗室温孵育30min，PBS洗去多余单抗。将包被FITC-CD133的免疫磁珠加入单个核细胞中，室温孵育30min，置于磁场中1min，弃细胞悬液，参照免疫磁珠试剂盒说明书分离出CD133+细胞。加入EGM-2MV培养基(hEGF，Hydrocortisone，VEGF，FGF-B，R3－IGF－1)，接种于包被Fibronectin的25cm2培养瓶中，37℃，饱和湿度培养。24h换液除去未贴壁细胞，3天后半量换液，培养3～4周。检测指标：①原代EPC的生长曲线：细胞以5×103个／孔的密度接种于96孔板。1～19天，隔日随机抽取4个培养孔，噻唑蓝(MTT)法测定各孔吸光度值，绘制细胞生长曲线。设不加细胞只加培养液为空白对照。②CDl33＋细胞分化：培养5天、10天的细胞分别加入FITC-CDl33单抗、CD34单抗、vWF单抗，室温孵育30min，PBS洗去多余单抗。加入辣根过氧化物酶标记二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色；取培养10天的细胞。③行透射电镜观察找Weibel-Palade小体。
1．3裸鼠成瘤实验：常规方法复苏、培养将胃癌GC7901细胞。取1×106个／1001×1原代培养EPC与1×106个／100μl胃癌GC7901细胞混合接种于裸鼠背部皮下。30天过量麻药腹腔注射处死裸鼠，取出肿瘤。40g／L多聚甲醛固定12h，常规石蜡切片vWF免疫组化染色。观察瘤体内EPC参与构成血管情况。
1．4裸鼠皮辦实验：取5×106EPC，90g(800rpm)，离心5min弃上清，加入稀释液(Diluent C)0．5ml，重悬取1μl PKH26荧光染液，迅速加入细胞悬液中室温孵育2～5min。加入1ml RPM11640／10％FBS培养基中止染色，调整细胞浓度为1×106／ml，荧光显微镜下观察。采用0．3％戊巴比妥钠腹腔麻醉。裸鼠腹腔注射0．5～0．7ml，3～5min麻醉生效后，根据设计于腹部肉膜层与深筋膜的浅面之间，将皮瓣仔细掀起，荧光标记EPC单细胞悬液100μl(1×105)，分成3点(远点、中点、蒂部)经皮辦软组织面均匀皮下注射于皮瓣。术后7天，过量麻药腹腔注射处死裸鼠，于皮辦中段切取组织，大小1．0cm×0．5cm。①细胞示踪：行冰冻切片，采用570nm波长，荧光显微镜观察。②常规石蜡切片vWF免疫组化染色，观察EPC参与构成血管情况。
1．5取对数生长期EPC及成纤维细胞与纤维蛋白原溶液(5g/L)按1：2：3混合，加入PGA材料(预先加入20u／40μl凝血酶)，37℃放置10min，混悬液便形成凝胶状固定于网孔中，加入EGM-2MV培养基培养。培养48h后，移植于裸鼠背部皮下。于裸鼠移植后21天取材，4％多聚甲醛固定。常规石蜡切片，vWF免疫酶组织化学染色，镜检。
2 结果
2．1 EPC传代培养后，细胞形态及密度均匀，前3天为相对抑制期，此后呈指数形式快速增殖，10天后达到80％～90％融合。EPC生长曲线(图1)显示：人脐血EPC接种后5天内细胞数量无明显增加，从第7天开始细胞数量明显增加，在第16天达到最高峰，以后增殖趋于平缓。
2．2原代EPC贴壁缓慢，24h后悬浮细胞重新接种 培养仍有细胞贴壁生长。EPC在Fibronectin包被的培养皿中培养24h后，可见到部分圆形大单核细胞粘附于培养瓶底，3天后细胞贴壁完全，少量细胞开始伸展，随着诱导培养时间的延长，圆形细胞逐渐减少，梭形细胞数量逐渐增多。7天左右出现由十数个细胞形成的细胞集落，可见20～30或更多数目细胞排列成内皮细胞特异性条索状结构或网格状结构。10天后形成明显克隆，并有梭形贴壁细胞从其边缘不断生成，2～3周，细胞长满培养瓶底，单层细胞呈多角形融合成片状(图2)。
2．3原代培养第10天细胞透射电镜显示：人脐血EPC平均直径15μm，核／浆比例大。细胞膜伸出许多伪足丝，基底膜呈多层。胞浆内可见一种短棒状小体，含平行管状的内部结构，即Weibel-Palade小体(图3)，是内皮细胞最具特征性的细胞器。
2．4 5只裸鼠接种细胞7天后均见肿瘤快速生长，抗人vWF免疫荧光组织化学染色显示大量EPC参与肿瘤血管构建(图4)。
2．5 EPC参与皮辦血管重建的观察：通过实验室体外培养，证实染色后细胞增殖活性无明显变化，在荧光显微镜下可以清楚地辨别细胞的轮廓，染料在细胞膜上分布均匀一致。通过移植后7天皮瓣中段真皮下层荧光显微镜观察，发现皮辦真皮下层存在能激发出红色荧光的细胞，多呈散在分布，或呈条索状分布(图5)，偶可见管状结构。并通过抗人vWF免疫酶组织化学染色，进一步证实EPC确实参与皮辦血管重建(图6)。
2．6 EPC、成纤维细胞与纤维蛋白原混悬液与凝血酶混合后，数秒钟后即形成胶冻状，数小时后可见细胞均匀分布于真皮支架的各个层面，并逐渐伸展为梭形或多极状，贴附于PGA支架纤维材料上(图7)，随培养时间的延长，细胞呈簇状聚集生长。移植21天，真皮替代物支架中的孔隙已完全被细胞和细胞外间质填充，支架部分降解，被大量平行排列的新生胶原纤维所替代，可见大量新生小血管形成，vWF免疫酶组织化学染色阳性(图8)，表明种植的EPC具有生物学活性，参与血管化过程。
3 讨论
内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是一类能循环、增殖并能直接分化为血管内皮细胞(endothelial cells，EC)，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型的前体细胞。以前认为EPC仅仅出现于胚胎血管发育阶段，在人出生后，并不存在EPC。但最近研究发现在脐带血、成人外周血、骨髓中的CD34＋细胞或flk 1+细胞或CD133+3细胞离体培养两周后均能分化为内皮细胞，从而证实成年个体中存在EPCI3-41。并且经异体骨髓移植模型证实，成年个体外周血中的EPC来源于骨髓，在受到血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子(G／M-CSF)等细胞因子以及缺氧刺激后可加速动员入外周血。在动物后肢缺血模型及大鼠急性心肌梗死模型中，人外周血、脐带血和骨髓来源的EPC移植均取得了很好的疗效。为临床缺血性疾病的血运重建提供了一种新的治疗策略。
目前对EPC发育分化的机制尚不十分清楚。EPC从原血干细胞而来，定向分化为内皮细胞，在此分化发育过程中，flk1是最先表达的内皮标志，其次是PECAM和Tie2的表达。成人外周血中的CD34+／ACl33+／flkl+EPC体外培养分化为成熟内皮细胞过程中，干细胞标志ACl33+逐渐下降，2周后完全消失，表明EPC是从原血干细胞到内皮细胞过程中的一个过渡的转瞬即逝的细胞表型阶段，随着系列定向和分化成熟，在某些基因的调控下，细胞表型逐渐改变。目前尚未发现EPC的特异性表面标记物，CD133是新近发现的干细胞标记，其表达在造血干／祖细胞分化过程中迅速下调，而不表达于CD34-群体。更重要的是CD34+／VEGFR-2+的细胞均表达CD133，这就使CD133成为富集EPC的理想细胞标记。
本实验采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CDl33+血管内皮祖细胞，通过CD133、CD34、vWF以及透射电镜对不同时期的细胞进行鉴定，证明此CD133+血管内皮祖细胞具有分化为成熟血管内皮细胞的能力。并通过裸鼠成瘤实验、皮辦实验及PGA移植实验证明EPC参与生成，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。
编辑／张惠娟
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[关键词]血管内皮祖细胞；CD133(AC133)：免疫磁珠
[中图分类号]Q254 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0015－04
一般认为内皮祖细胞(endothelial progenitor Cell，EPC)仅见于胚胎时期，但近年来，越来越多的证据表明在成年个体中也存在少量的EPC。1997年ASahara等报道在成人外周血中分离出EPC，体外培养呈梭形，具有形成管腔样结构的能力，且能够表达成熟内皮细胞的特异性抗原，在动物实验中可参与新生血管的形成，此后，又陆续观察到骨髓和脐带血中均存在EPC。EPC具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。本实验采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养EPC，观察EPC在体内缺氧条件下分化成内皮细胞，并参与血管生成，为治疗性血管发生研究及组织器官移植提供种子细胞。
1 材料和方法
1．1主要试剂及标本来源：胃癌GC7901细胞株由第四军医大学实验动物研究中心细胞库提供)；ACD—B抗凝液(上海市血液中心)：1．077淋巴细胞分离液(天津TBD公司)；免疫磁珠试剂盒(挪威DYNAL公司)；Fibronectin(美国Sigma公司)：异硫氰酸荧光素(FITC)CDl33单抗(美国R&D公司)；抗人vWF单抗(英国Serotec公司)；F1RC－二抗及辣根过氧化物酶标记二抗、CD34单抗(丹麦DAKO公司)；EGM-2MV培养基(美国Cambrex公司)；细胞荧光染色试剂盒(PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit，Sigma，美国)；人纤维蛋白原(Fibronogen，Sigma，美国)：人凝血酶(Thrombin 500，IMMUNO AG，奥地利)：PGA真皮替代物(NEOVEIL，日本)。BALB／c，nu／lnu裸小鼠15只，雌雄不限，鼠龄4～6周，体重18～23g(第四军医大学实验动物研究中心)；人脐血标本来源于本院34例妇产科健康产妇(产妇均知情同意)。
1．2 EPC分离及诱导分化培养：ACD-B抗凝脐血，1：2加入磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，取7ml缓慢加入3ml淋巴细胞分离液，621×g离心30min，取单个核细胞层，PBS洗涤3次去血小板。免疫磁珠与FITC-CDl33单抗室温孵育30min，PBS洗去多余单抗。将包被FITC-CD133的免疫磁珠加入单个核细胞中，室温孵育30min，置于磁场中1min，弃细胞悬液，参照免疫磁珠试剂盒说明书分离出CD133+细胞。加入EGM-2MV培养基(hEGF，Hydrocortisone，VEGF，FGF-B，R3－IGF－1)，接种于包被Fibronectin的25cm2培养瓶中，37℃，饱和湿度培养。24h换液除去未贴壁细胞，3天后半量换液，培养3～4周。检测指标：①原代EPC的生长曲线：细胞以5×103个／孔的密度接种于96孔板。1～19天，隔日随机抽取4个培养孔，噻唑蓝(MTT)法测定各孔吸光度值，绘制细胞生长曲线。设不加细胞只加培养液为空白对照。②CDl33＋细胞分化：培养5天、10天的细胞分别加入FITC-CDl33单抗、CD34单抗、vWF单抗，室温孵育30min，PBS洗去多余单抗。加入辣根过氧化物酶标记二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色；取培养10天的细胞。③行透射电镜观察找Weibel-Palade小体。
1．3裸鼠成瘤实验：常规方法复苏、培养将胃癌GC7901细胞。取1×106个／1001×1原代培养EPC与1×106个／100μl胃癌GC7901细胞混合接种于裸鼠背部皮下。30天过量麻药腹腔注射处死裸鼠，取出肿瘤。40g／L多聚甲醛固定12h，常规石蜡切片vWF免疫组化染色。观察瘤体内EPC参与构成血管情况。
1．4裸鼠皮辦实验：取5×106EPC，90g(800rpm)，离心5min弃上清，加入稀释液(Diluent C)0．5ml，重悬取1μl PKH26荧光染液，迅速加入细胞悬液中室温孵育2～5min。加入1ml RPM11640／10％FBS培养基中止染色，调整细胞浓度为1×106／ml，荧光显微镜下观察。采用0．3％戊巴比妥钠腹腔麻醉。裸鼠腹腔注射0．5～0．7ml，3～5min麻醉生效后，根据设计于腹部肉膜层与深筋膜的浅面之间，将皮瓣仔细掀起，荧光标记EPC单细胞悬液100μl(1×105)，分成3点(远点、中点、蒂部)经皮辦软组织面均匀皮下注射于皮瓣。术后7天，过量麻药腹腔注射处死裸鼠，于皮辦中段切取组织，大小1．0cm×0．5cm。①细胞示踪：行冰冻切片，采用570nm波长，荧光显微镜观察。②常规石蜡切片vWF免疫组化染色，观察EPC参与构成血管情况。
1．5取对数生长期EPC及成纤维细胞与纤维蛋白原溶液(5g/L)按1：2：3混合，加入PGA材料(预先加入20u／40μl凝血酶)，37℃放置10min，混悬液便形成凝胶状固定于网孔中，加入EGM-2MV培养基培养。培养48h后，移植于裸鼠背部皮下。于裸鼠移植后21天取材，4％多聚甲醛固定。常规石蜡切片，vWF免疫酶组织化学染色，镜检。
2 结果
2．1 EPC传代培养后，细胞形态及密度均匀，前3天为相对抑制期，此后呈指数形式快速增殖，10天后达到80％～90％融合。EPC生长曲线(图1)显示：人脐血EPC接种后5天内细胞数量无明显增加，从第7天开始细胞数量明显增加，在第16天达到最高峰，以后增殖趋于平缓。
2．2原代EPC贴壁缓慢，24h后悬浮细胞重新接种 培养仍有细胞贴壁生长。EPC在Fibronectin包被的培养皿中培养24h后，可见到部分圆形大单核细胞粘附于培养瓶底，3天后细胞贴壁完全，少量细胞开始伸展，随着诱导培养时间的延长，圆形细胞逐渐减少，梭形细胞数量逐渐增多。7天左右出现由十数个细胞形成的细胞集落，可见20～30或更多数目细胞排列成内皮细胞特异性条索状结构或网格状结构。10天后形成明显克隆，并有梭形贴壁细胞从其边缘不断生成，2～3周，细胞长满培养瓶底，单层细胞呈多角形融合成片状(图2)。
2．3原代培养第10天细胞透射电镜显示：人脐血EPC平均直径15μm，核／浆比例大。细胞膜伸出许多伪足丝，基底膜呈多层。胞浆内可见一种短棒状小体，含平行管状的内部结构，即Weibel-Palade小体(图3)，是内皮细胞最具特征性的细胞器。
2．4 5只裸鼠接种细胞7天后均见肿瘤快速生长，抗人vWF免疫荧光组织化学染色显示大量EPC参与肿瘤血管构建(图4)。
2．5 EPC参与皮辦血管重建的观察：通过实验室体外培养，证实染色后细胞增殖活性无明显变化，在荧光显微镜下可以清楚地辨别细胞的轮廓，染料在细胞膜上分布均匀一致。通过移植后7天皮瓣中段真皮下层荧光显微镜观察，发现皮辦真皮下层存在能激发出红色荧光的细胞，多呈散在分布，或呈条索状分布(图5)，偶可见管状结构。并通过抗人vWF免疫酶组织化学染色，进一步证实EPC确实参与皮辦血管重建(图6)。
2．6 EPC、成纤维细胞与纤维蛋白原混悬液与凝血酶混合后，数秒钟后即形成胶冻状，数小时后可见细胞均匀分布于真皮支架的各个层面，并逐渐伸展为梭形或多极状，贴附于PGA支架纤维材料上(图7)，随培养时间的延长，细胞呈簇状聚集生长。移植21天，真皮替代物支架中的孔隙已完全被细胞和细胞外间质填充，支架部分降解，被大量平行排列的新生胶原纤维所替代，可见大量新生小血管形成，vWF免疫酶组织化学染色阳性(图8)，表明种植的EPC具有生物学活性，参与血管化过程。
3 讨论
内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是一类能循环、增殖并能直接分化为血管内皮细胞(endothelial cells，EC)，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型的前体细胞。以前认为EPC仅仅出现于胚胎血管发育阶段，在人出生后，并不存在EPC。但最近研究发现在脐带血、成人外周血、骨髓中的CD34＋细胞或flk 1+细胞或CD133+3细胞离体培养两周后均能分化为内皮细胞，从而证实成年个体中存在EPCI3-41。并且经异体骨髓移植模型证实，成年个体外周血中的EPC来源于骨髓，在受到血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子(G／M-CSF)等细胞因子以及缺氧刺激后可加速动员入外周血。在动物后肢缺血模型及大鼠急性心肌梗死模型中，人外周血、脐带血和骨髓来源的EPC移植均取得了很好的疗效。为临床缺血性疾病的血运重建提供了一种新的治疗策略。
目前对EPC发育分化的机制尚不十分清楚。EPC从原血干细胞而来，定向分化为内皮细胞，在此分化发育过程中，flk1是最先表达的内皮标志，其次是PECAM和Tie2的表达。成人外周血中的CD34+／ACl33+／flkl+EPC体外培养分化为成熟内皮细胞过程中，干细胞标志ACl33+逐渐下降，2周后完全消失，表明EPC是从原血干细胞到内皮细胞过程中的一个过渡的转瞬即逝的细胞表型阶段，随着系列定向和分化成熟，在某些基因的调控下，细胞表型逐渐改变。目前尚未发现EPC的特异性表面标记物，CD133是新近发现的干细胞标记，其表达在造血干／祖细胞分化过程中迅速下调，而不表达于CD34-群体。更重要的是CD34+／VEGFR-2+的细胞均表达CD133，这就使CD133成为富集EPC的理想细胞标记。
本实验采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CDl33+血管内皮祖细胞，通过CD133、CD34、vWF以及透射电镜对不同时期的细胞进行鉴定，证明此CD133+血管内皮祖细胞具有分化为成熟血管内皮细胞的能力。并通过裸鼠成瘤实验、皮辦实验及PGA移植实验证明EPC参与生成，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。