论文部分内容阅读
摘要 利用PCR技术扩增山东境内的3个克氏原鳌虾地理群体（济南小清河、东平湖和微山湖）CO Ⅰ基因片段，得到长度约为874bp的片段，分析比较了3群体87尾克氏原螯虾CO Ⅰ基因序列的变异和遗传结构。结果显示，87条序列共检测到8个变异位点，存在6种单倍型。单倍型多样性（H）为0.174，核苷酸多样性（Pi）为0.0036，单倍型多样性（H）以东平湖群体最高（0.243 ），微山湖群体其次（0.204），小清河群体最低（0.000）；3群体的核苷酸多样性（H）均较低（<0.001）。分子变异等级分析（AMOVA）表明，3群体间总的遗传分化指数（Fst）为0.023 85（P>0.05），群体间的遗传变异仅占总遗传变异的2.38%，而97.62%的遗传变异源于群体内，群体间遗传分化指数与遗传距离均较低。表明山东克氏原鳌虾野生群体的遗传多样性较低，具有较低的遗传分化水平。
关键词 克氏原鳌虾； CO Ⅰ；遗传多样性
中图分类号 S917；Q958.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-041-04
Abstract By PCR amplification， partial CO Ⅰ sequences with an aligned length of 874 bp were obtained from 3 Procambarus clarkii geographical population （Xiaoqing River in Jinan， Dongping Lake and Weishan Lake） in Shandong Province. Variation and genetic structure of partial CO Ⅰ sequences were analyzed from 87 individuals of these populations. A total of 6 haplotypes and 8 variable sites were detected. The highest haplotype diversity was in Dongping Lake population （0.243）， while the lowest haplotype diversity was Xiaoqing River population （0.000）. AMOVA showed that the FST among 3 population were 0.023 85 （P>0.05）. Genetic variation among populations accounted for only 2.38% of the total genetic variation， while 97.62% of genetic variation was from groups. Index of genetic differentiation and genetic distance between groups were lower. Results indicated that the genetic diversity of these 3 wild populations was low， and the 3 wild populations had lower genetic differentiation.
Key words Procambarus clarkii； CO Ⅰ； Genetic diversity
克氏原鰲虾（Procambarus clarkii） 俗称小龙虾，属螯虾科原螯虾属，其肉味鲜美， 高蛋白低脂肪， 富含钙、磷、铁等矿物质，深受消费者喜爱。现已广泛分布于我国中东部地区十余个省市，成为一些湖泊和沟渠的优势种群[1]，是我国重要的水产经济物种。分子标记是分析群体遗传多样性的一种有效手段，学者利用AFLP、SSR、ISSR、RAPD等方法对克氏原螯虾群体的遗传多样性进行研究，黄羽等[2]、宋亮等[3]利用AFLP方法进行克氏原螯虾遗传多样性分析，揭示了长江中下游地区6个群体的遗传变异主要存在于群体内，随州、济南、宁波和常熟4群体具有丰富的遗传多样性，且群体间存在较明显的遗传分化；王长忠等[4]、邢智珺等[5]利用SSR方法进行了克氏原螯虾遗传多样性分析，揭示了长江4个群体遗传多样性处于中等水平，江苏8个地理群体遗传多样性水平较高且群体间存在中度分化；韩晓磊等[6]对2个克氏原螯虾群体遗传多样性进行了ISSR分析，显示2野生群体存在一定程度的遗传分化，遗传变异主要存在于群体内个体间；张龙岗等[7]、张玮等[8]分别对克氏原螯虾不同野生群体进行了遗传差异的RAPD分析。利用线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基（CO Ⅰ）基因对克氏原螯虾群体遗传多样性的研究相对较少，笔者利用CO Ⅰ基因对山东省内3个克氏原螯虾野生地理群体的遗传多样性状况、遗传结构及遗传变异水平进行本底调查，以期为其种群遗传多样性评估、种质资源保护和遗传育种提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
克氏原螯虾分别采自于山东济南小清河（QH）、济宁微山湖（WS）和泰安东平湖（DP）的野生群体，每组群体样本数量为28～31个； PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成；DNA提取试剂盒（SK1206）购自上海生工生物技术有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP 、MgCl2、Marker等为大连宝生物工程有限公司生产；PCR仪为Takara TP650型。
1.2 方法
1.2.1
基因组DNA的提取。取克氏原螯虾肉约20 mg，用DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA，经OD260/OD280比值和琼脂糖凝胶电泳检测浓度和纯度。 1.2.2
引物设计及PCR扩增。根据GenBank（NC_016926.1）中的相应序列，设计并合成一对引物，用于CO Ⅰ基因序列的扩增，引物序列为
CO ⅠS： 5′ACGCAACGATGATTTTTTTCT3′；
CO ⅠA： 5′CATCCATCCCTACCGTAAATA 3′。
PCR扩增体系50 μl，扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s， 51 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸50 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物技术有限公司，純化后采用上述引物进行双向测序。
1.2.3
序列分析。所测得的DNA序列经DNASTAR软件拼接并辅以人工校，与从GenBank中下载的克氏原螯虾相应序列用Clustal W方法进行比对分析和确定长度，采用MEGA 5.2 软件统计序列的碱基组成和转换/颠换比率（Ts/Tv ratios）、变异位点，采用Kimura 2parameter模型计算群体间的遗传距离，采用Kimura 2parameter距离矩阵，邻接法（NeighborJoining，NJ）构建单倍型分子系统树，自举检测（bootstrap）1000次计算各分支置信度；用DNASP V5计算单倍型多样性指数（Hd）和核苷酸多样性指数（π）；使用Arlequin3.5软件中的分子变异分析（AMOVA）方法估算遗传变异在群体内和群体间的分布及遗传分化指数（Fstatistics，Fst）。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
采用引物CO ⅠS和CO ⅠA对3个不同地理群体克氏原螯虾的基因组DNA进行PCR扩增，结果都扩增出一条约900 bp条带（图1）。
2.2 CO Ⅰ基因片段的序列分析
2.2.1
序列分析。对克氏原螯虾3群体87个样本线粒体CO Ⅰ基因进行了测序，结果经DNASTAR软件拼接并辅以人工校对，去除部分端序列后，获得874 bp的片段，经BLAST分析，与GenBank（NC_016926.1）中的克氏原螯虾CO Ⅰ基因片段同源性高达99%，确定该产物为克氏原螯虾CO Ⅰ基因的部分序列。
用CLUSTALW软件对测得序列及GenBank中（NC_016926.1）的同源序列进行比对分析，共有8个变异位点（占位点总数的0.9%），其中有5个转换（transition），3个颠换（transversion），转换颠换比（Ts/Tv）为1.67∶1.00， 变异位点多发生在第3密码子上，没有碱基的插入与缺失。在编码的296个氨基酸序列中，有1处氨基酸替代，由密码子第一位点上的核苷酸替代引起。
87个样本共检测到6种单倍型（表1），其中3群体的共享单倍型1个（Hap1），单倍型Hap2、Hap3、Hap4为DP群体所特有，单倍型Hap5、Hap6为WS群体所特有，即DP 群体拥有4种单倍型，WS群体有3种单倍型，而QH群体只有1种单倍型。除共享单倍型外的5种单倍型出现频率较低，只有1～2个样本。
2.2.2
碱基组成和遗传距离。
采用MGEA 5.2软件统计3个群体克氏原螯虾CO Ⅰ基因部分序列的碱基组成和G+G含量（表2）。G+C含量（32.0%）显著低于A+T含量（68%），其中碱基C的含量最低，只有12.1%，且在1、2、3位的含量变化很大，分别为12.0%、23.4%和1.0%。DP群体内的相对遗传距离（Pdistance）为0～0.007，WS群体内的遗传距离为0～0.002，QH群体内的遗传距离为0。
克氏原螯虾CO Ⅰ基因6种单倍型序列间的遗传距离见表3，利用Kimura双参数模型计算，置信度估算采用Kimura的双参数法，重复数1 000，结果显示各单倍型间的遗传距离在0.001～0.007。
2.2.3
不同群体遗传多样性及遗传分化分析。利用DnaSP 5.1软件进行3群体克氏原螯虾CO Ⅰ基因遗传多样性分析（表4），结果表明，DP和WS群体具有较高的单倍型多样性（Hd），分别为0.243和0.204，而小清河群体单倍型多样性非常低，为0。3群体核苷酸多样性（Pi）水平与平均核苷酸差异数（K）都较低。
分子变异等级分析（AMOVA）结果表明，群体间遗传分化指数Fst=0.023 85（ P>0.05），表明在整个遗传变异中不同群体间的遗传分化只占2.38%，其余97.62%的遗传分化来自群体内的个体间。群体间的遗传分化指数Fst及3群体间的遗传距离见表5，显示3群体间DP和WS间的遗传分化指数最低（Fst=-0.004 82），DP和QH群体间的遗传分化指数最高（Fst=0.052 59），表明根据线粒体CO Ⅰ基因的序列，3个群体中没有显著的遗传分化（P>0.05）。
从3群体间的遗传距离来看，DP和WS群体的遗传距离最大（0.000 42），DP和QH群体的遗传距离最小（0.000 12），表明遗传距离与地理距离没有相关性。
2.2.4
系统发育和聚类分析。根据6个单倍型序列和GenBank中检索的同源序列（NC_016926.1），采用双参数模型（Kimura 2parameter）作为距离参数，邻接法（neighberjoining，NJ）构建系统进化树，自举检测（bootstrap）1000次计算各分支置信度（图2）。由图2可知，Hap1、Hap2和GenBank汇成一支，另外4个单倍型汇成一支，可以看出DP群体拥有的4种单倍型在各分支上都有分布，各群体间存在较为广泛的共享单倍型，未表现出明显的地理位置与单倍型之间的对应关系。 利用MGEA 5.2软件构建了87个克氏原螯虾个体的UPGMA系统进化树（图3），也揭示了克氏原螯虾山东3群体不是按照地理位置形成对应族群的，绝大多数个体聚为一大类后和WS群体的部分个体群聚为一支， DP群体的部分个体自成一支。
3 讨论
动物线粒体 CO Ⅰ基因进化速度较快，适合种群水平差异的检测，也可用于种间分析，彭士明等[9]、马凌波等[10]、姜虎成等[11] 、朱立静等[12]通过分析银鲳、青蟹、日本沼虾、四角蛤喇等物种群体的线粒体CO Ⅰ基因序列差异研究其遗传结构和系统演化。该研究通过分析山东3个不同地理群体克氏原螯虾CO Ⅰ基因序列的差异来探讨其遗传结构、遗传分化和进化关系。
3.1 遗传多样性
种群内和种群间的遗传多样性水平是反映物种遗传背景的科学资料，该研究表明，在克氏原螯虾3群体87个样本扩增的 CO Ⅰ基因874 bp片段中，存在8个突变位点，有6种单倍型。3群体核苷酸多样性（Pi）为0.000 29±0.000 12，平均核苷酸差异数（K）0.251±0.082。单倍型多样性分析表明，DP和 WS群体较高，QH群体最低，与张龙岗等[7]研究的群体遗传多样性为WS >DP >QH的RAPD分析结果相似。总体而言，3群体的遗传多样性处于较低的水平，各群体间存在较为广泛的共享单倍型，未表现出明显的地理位置与单倍型之间的对应关系。这是因为克氏原螯虾为外来物种，因奠基者效应或瓶颈效应的影响，由于克氏原螯虾适应环境的能力非常强，环境的选择压力对其影响不大，形成基因突变和重组的概率很小，也未见由国外多次引入的报道，故其遗传多样性增加的可能性微乎其微，故而呈现出遗传多样性降低的现象。相对而言，DP和WS群体的遗传多样性水平比QH群体高，这是因为东平湖和微山湖一带小龙虾养殖业发展迅猛，和长江流域存在基因交流，人为因素使得其遗传多样性水平相对较高；而QH群体因生存环境相对封闭，克氏原螯虾定居性较强，游泳能力弱，自身迁徙能力差，与其他群体缺乏交流，加之近些年过度捕捞，造成自然资源锐减和种群内近亲交配，导致遗传多样性水平逐渐降低。王长忠等[4]利用AFLP技术进行研究，结果表明，克氏原螯虾群体遗传多样性为宁波群体>随州群体>济南群体>常熟群体，也证明济南群体处于较低的遗传多样性水平。
3.2 遗传分化
AMOVA分析的Fst值是用来测量群体间遗传分化的指标，Fst值越小说明群体间发生遗传分化越低，一般认为Fst<0.05认为遗传分化程度很小；0.050.25表示有显著差异。该研究中群体间Fst=0.023 85（P>0.05），表明群体间的遗传分化程度较低，在整个遗传变异中群体间占2.38%，其余的遗传变异来自于群体内，3个群体中DP和QH间的Fst值最大（0.052 59），两者间的遗传分化最大， DP和WS间的Fst最小（-0.004 82），即两者间的遗传分化最小，与张龙岗等[7]的研究结果类似。DP和WS群体间的遗传距离最大，DP和QH群体间的遺传距离最小（0.000 12），可能与DP和WS群体CO Ⅰ基因具有独有单倍型有关，导致遗传分化大的遗传距离反而小。很多情况下，遗传分化大的2个群体间遗传距离不一定最大[13]，群体间Fst值虽然大小与其趋势不一致，但该研究Fst值都不显著，说明3个群体间不存在遗传分化，这个Fst和遗传距离不是对应的。
UPGMA系统关系树也反映出它们的系统进化情况，绝大多数个体聚为一大类后和WS群体的部分个体群聚为一支， DP群体的部分个体自成一支，由此推测，可能东平湖群体更接近于外来原始种群，微山湖群体和小清河群体由东平湖群体演化而来。
该研究山东3个克氏原螯虾野生群体间的遗传分化较低，群体间还没有形成互相隔离的遗传结构，鉴于此，在克氏原螯虾选育过程中，应以东平湖群体作为基础群体，并适当引进外地良种，以获得更多遗传多样性水平，促进克氏原螯虾养殖业的健康发展。
参考文献
[1]王卫民.软壳克氏原螯虾在我国开发利用前景[J].水生生物学报，1999，23（4）：375-381.
[2] 黄羽，戴银根，毕成武，等.长江中下游地区6个克氏原螯虾群体遗传多样性分析[J].南昌大学学报，2011，33（3）：243-247.
[3] 宋亮，韩晓磊，夏蝉，等.不同地区克氏原螯虾遗传多样性的AFLP分析[J].江苏农业学报，2012，28（2）：359-364.
[4] 王长忠，李忠，梁宏伟，等.长江下游地区4个克氏原螯虾群体的遗传多样性分析[J].生物多样性，2009，17（5）：518-523.
[5] 邢智珺，江虎成，陆伟，等.江苏8个克氏原螯虾群体遗传多样性微卫星分析[J].上海海洋大学学报，2014，23（5）：656-661.
[6] 韩晓磊，徐松维，李小蕊，等.克氏原螯虾群体遗传多样性的ISSR分析[J].江苏农业科学，2011，39（4）：26-29.
[7] 张龙岗，杨玲，刘羽清，等.山东克氏原螯虾3个地理群体遗传差异的RAPD 分析[J].长江大学学报，2014，11（17）：37-40.
[8] 张玮，阮龙，陈义红，等.克氏原螯虾4个地理群体遗传差异的RAPD分析[J].安徽农业科学，2010，38（22）：11861-11862，11876.
[9] 彭士明，施兆鸿，侯俊利，等.银鲳3个野生群体线粒体CO Ⅰ基因的序列差异分析[J].上海海洋大学学报，2009，18（4）：398-402.
[10] 马凌波，张凤英，乔振国，等.中国东南沿海青蟹线粒体CO Ⅰ基因部分序列分析[J].水产学报，2006，30（4）：463-467.
[11] 姜虎成，冯建彬，丁怀宇，等.淮河水系日本沼虾群体遗传结构和系统演化的线粒体CO Ⅰ序列分析[J].动物学杂志，2012，47（2）：73-84.
[12] 朱立静，陈淑吟，许晓风，等.四角蛤喇江苏群体线粒体CO Ⅰ基因片段序列研究[J].江苏农业科学，2010，38（4）：33-35，97.
[13] 张东亚，汪登强，刘绍平，等.怒江频危鱼类缺须盆唇鱼基于线粒体Cyt b 序列的群体遗传结构分析[J].中国水产科学，2009，16（4）：477-485.
关键词 克氏原鳌虾； CO Ⅰ；遗传多样性
中图分类号 S917；Q958.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-041-04
Abstract By PCR amplification， partial CO Ⅰ sequences with an aligned length of 874 bp were obtained from 3 Procambarus clarkii geographical population （Xiaoqing River in Jinan， Dongping Lake and Weishan Lake） in Shandong Province. Variation and genetic structure of partial CO Ⅰ sequences were analyzed from 87 individuals of these populations. A total of 6 haplotypes and 8 variable sites were detected. The highest haplotype diversity was in Dongping Lake population （0.243）， while the lowest haplotype diversity was Xiaoqing River population （0.000）. AMOVA showed that the FST among 3 population were 0.023 85 （P>0.05）. Genetic variation among populations accounted for only 2.38% of the total genetic variation， while 97.62% of genetic variation was from groups. Index of genetic differentiation and genetic distance between groups were lower. Results indicated that the genetic diversity of these 3 wild populations was low， and the 3 wild populations had lower genetic differentiation.
Key words Procambarus clarkii； CO Ⅰ； Genetic diversity
克氏原鰲虾（Procambarus clarkii） 俗称小龙虾，属螯虾科原螯虾属，其肉味鲜美， 高蛋白低脂肪， 富含钙、磷、铁等矿物质，深受消费者喜爱。现已广泛分布于我国中东部地区十余个省市，成为一些湖泊和沟渠的优势种群[1]，是我国重要的水产经济物种。分子标记是分析群体遗传多样性的一种有效手段，学者利用AFLP、SSR、ISSR、RAPD等方法对克氏原螯虾群体的遗传多样性进行研究，黄羽等[2]、宋亮等[3]利用AFLP方法进行克氏原螯虾遗传多样性分析，揭示了长江中下游地区6个群体的遗传变异主要存在于群体内，随州、济南、宁波和常熟4群体具有丰富的遗传多样性，且群体间存在较明显的遗传分化；王长忠等[4]、邢智珺等[5]利用SSR方法进行了克氏原螯虾遗传多样性分析，揭示了长江4个群体遗传多样性处于中等水平，江苏8个地理群体遗传多样性水平较高且群体间存在中度分化；韩晓磊等[6]对2个克氏原螯虾群体遗传多样性进行了ISSR分析，显示2野生群体存在一定程度的遗传分化，遗传变异主要存在于群体内个体间；张龙岗等[7]、张玮等[8]分别对克氏原螯虾不同野生群体进行了遗传差异的RAPD分析。利用线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基（CO Ⅰ）基因对克氏原螯虾群体遗传多样性的研究相对较少，笔者利用CO Ⅰ基因对山东省内3个克氏原螯虾野生地理群体的遗传多样性状况、遗传结构及遗传变异水平进行本底调查，以期为其种群遗传多样性评估、种质资源保护和遗传育种提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
克氏原螯虾分别采自于山东济南小清河（QH）、济宁微山湖（WS）和泰安东平湖（DP）的野生群体，每组群体样本数量为28～31个； PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成；DNA提取试剂盒（SK1206）购自上海生工生物技术有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP 、MgCl2、Marker等为大连宝生物工程有限公司生产；PCR仪为Takara TP650型。
1.2 方法
1.2.1
基因组DNA的提取。取克氏原螯虾肉约20 mg，用DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA，经OD260/OD280比值和琼脂糖凝胶电泳检测浓度和纯度。 1.2.2
引物设计及PCR扩增。根据GenBank（NC_016926.1）中的相应序列，设计并合成一对引物，用于CO Ⅰ基因序列的扩增，引物序列为
CO ⅠS： 5′ACGCAACGATGATTTTTTTCT3′；
CO ⅠA： 5′CATCCATCCCTACCGTAAATA 3′。
PCR扩增体系50 μl，扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s， 51 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸50 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物技术有限公司，純化后采用上述引物进行双向测序。
1.2.3
序列分析。所测得的DNA序列经DNASTAR软件拼接并辅以人工校，与从GenBank中下载的克氏原螯虾相应序列用Clustal W方法进行比对分析和确定长度，采用MEGA 5.2 软件统计序列的碱基组成和转换/颠换比率（Ts/Tv ratios）、变异位点，采用Kimura 2parameter模型计算群体间的遗传距离，采用Kimura 2parameter距离矩阵，邻接法（NeighborJoining，NJ）构建单倍型分子系统树，自举检测（bootstrap）1000次计算各分支置信度；用DNASP V5计算单倍型多样性指数（Hd）和核苷酸多样性指数（π）；使用Arlequin3.5软件中的分子变异分析（AMOVA）方法估算遗传变异在群体内和群体间的分布及遗传分化指数（Fstatistics，Fst）。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
采用引物CO ⅠS和CO ⅠA对3个不同地理群体克氏原螯虾的基因组DNA进行PCR扩增，结果都扩增出一条约900 bp条带（图1）。
2.2 CO Ⅰ基因片段的序列分析
2.2.1
序列分析。对克氏原螯虾3群体87个样本线粒体CO Ⅰ基因进行了测序，结果经DNASTAR软件拼接并辅以人工校对，去除部分端序列后，获得874 bp的片段，经BLAST分析，与GenBank（NC_016926.1）中的克氏原螯虾CO Ⅰ基因片段同源性高达99%，确定该产物为克氏原螯虾CO Ⅰ基因的部分序列。
用CLUSTALW软件对测得序列及GenBank中（NC_016926.1）的同源序列进行比对分析，共有8个变异位点（占位点总数的0.9%），其中有5个转换（transition），3个颠换（transversion），转换颠换比（Ts/Tv）为1.67∶1.00， 变异位点多发生在第3密码子上，没有碱基的插入与缺失。在编码的296个氨基酸序列中，有1处氨基酸替代，由密码子第一位点上的核苷酸替代引起。
87个样本共检测到6种单倍型（表1），其中3群体的共享单倍型1个（Hap1），单倍型Hap2、Hap3、Hap4为DP群体所特有，单倍型Hap5、Hap6为WS群体所特有，即DP 群体拥有4种单倍型，WS群体有3种单倍型，而QH群体只有1种单倍型。除共享单倍型外的5种单倍型出现频率较低，只有1～2个样本。
2.2.2
碱基组成和遗传距离。
采用MGEA 5.2软件统计3个群体克氏原螯虾CO Ⅰ基因部分序列的碱基组成和G+G含量（表2）。G+C含量（32.0%）显著低于A+T含量（68%），其中碱基C的含量最低，只有12.1%，且在1、2、3位的含量变化很大，分别为12.0%、23.4%和1.0%。DP群体内的相对遗传距离（Pdistance）为0～0.007，WS群体内的遗传距离为0～0.002，QH群体内的遗传距离为0。
克氏原螯虾CO Ⅰ基因6种单倍型序列间的遗传距离见表3，利用Kimura双参数模型计算，置信度估算采用Kimura的双参数法，重复数1 000，结果显示各单倍型间的遗传距离在0.001～0.007。
2.2.3
不同群体遗传多样性及遗传分化分析。利用DnaSP 5.1软件进行3群体克氏原螯虾CO Ⅰ基因遗传多样性分析（表4），结果表明，DP和WS群体具有较高的单倍型多样性（Hd），分别为0.243和0.204，而小清河群体单倍型多样性非常低，为0。3群体核苷酸多样性（Pi）水平与平均核苷酸差异数（K）都较低。
分子变异等级分析（AMOVA）结果表明，群体间遗传分化指数Fst=0.023 85（ P>0.05），表明在整个遗传变异中不同群体间的遗传分化只占2.38%，其余97.62%的遗传分化来自群体内的个体间。群体间的遗传分化指数Fst及3群体间的遗传距离见表5，显示3群体间DP和WS间的遗传分化指数最低（Fst=-0.004 82），DP和QH群体间的遗传分化指数最高（Fst=0.052 59），表明根据线粒体CO Ⅰ基因的序列，3个群体中没有显著的遗传分化（P>0.05）。
从3群体间的遗传距离来看，DP和WS群体的遗传距离最大（0.000 42），DP和QH群体的遗传距离最小（0.000 12），表明遗传距离与地理距离没有相关性。
2.2.4
系统发育和聚类分析。根据6个单倍型序列和GenBank中检索的同源序列（NC_016926.1），采用双参数模型（Kimura 2parameter）作为距离参数，邻接法（neighberjoining，NJ）构建系统进化树，自举检测（bootstrap）1000次计算各分支置信度（图2）。由图2可知，Hap1、Hap2和GenBank汇成一支，另外4个单倍型汇成一支，可以看出DP群体拥有的4种单倍型在各分支上都有分布，各群体间存在较为广泛的共享单倍型，未表现出明显的地理位置与单倍型之间的对应关系。 利用MGEA 5.2软件构建了87个克氏原螯虾个体的UPGMA系统进化树（图3），也揭示了克氏原螯虾山东3群体不是按照地理位置形成对应族群的，绝大多数个体聚为一大类后和WS群体的部分个体群聚为一支， DP群体的部分个体自成一支。
3 讨论
动物线粒体 CO Ⅰ基因进化速度较快，适合种群水平差异的检测，也可用于种间分析，彭士明等[9]、马凌波等[10]、姜虎成等[11] 、朱立静等[12]通过分析银鲳、青蟹、日本沼虾、四角蛤喇等物种群体的线粒体CO Ⅰ基因序列差异研究其遗传结构和系统演化。该研究通过分析山东3个不同地理群体克氏原螯虾CO Ⅰ基因序列的差异来探讨其遗传结构、遗传分化和进化关系。
3.1 遗传多样性
种群内和种群间的遗传多样性水平是反映物种遗传背景的科学资料，该研究表明，在克氏原螯虾3群体87个样本扩增的 CO Ⅰ基因874 bp片段中，存在8个突变位点，有6种单倍型。3群体核苷酸多样性（Pi）为0.000 29±0.000 12，平均核苷酸差异数（K）0.251±0.082。单倍型多样性分析表明，DP和 WS群体较高，QH群体最低，与张龙岗等[7]研究的群体遗传多样性为WS >DP >QH的RAPD分析结果相似。总体而言，3群体的遗传多样性处于较低的水平，各群体间存在较为广泛的共享单倍型，未表现出明显的地理位置与单倍型之间的对应关系。这是因为克氏原螯虾为外来物种，因奠基者效应或瓶颈效应的影响，由于克氏原螯虾适应环境的能力非常强，环境的选择压力对其影响不大，形成基因突变和重组的概率很小，也未见由国外多次引入的报道，故其遗传多样性增加的可能性微乎其微，故而呈现出遗传多样性降低的现象。相对而言，DP和WS群体的遗传多样性水平比QH群体高，这是因为东平湖和微山湖一带小龙虾养殖业发展迅猛，和长江流域存在基因交流，人为因素使得其遗传多样性水平相对较高；而QH群体因生存环境相对封闭，克氏原螯虾定居性较强，游泳能力弱，自身迁徙能力差，与其他群体缺乏交流，加之近些年过度捕捞，造成自然资源锐减和种群内近亲交配，导致遗传多样性水平逐渐降低。王长忠等[4]利用AFLP技术进行研究，结果表明，克氏原螯虾群体遗传多样性为宁波群体>随州群体>济南群体>常熟群体，也证明济南群体处于较低的遗传多样性水平。
3.2 遗传分化
AMOVA分析的Fst值是用来测量群体间遗传分化的指标，Fst值越小说明群体间发生遗传分化越低，一般认为Fst<0.05认为遗传分化程度很小；0.05
UPGMA系统关系树也反映出它们的系统进化情况，绝大多数个体聚为一大类后和WS群体的部分个体群聚为一支， DP群体的部分个体自成一支，由此推测，可能东平湖群体更接近于外来原始种群，微山湖群体和小清河群体由东平湖群体演化而来。
该研究山东3个克氏原螯虾野生群体间的遗传分化较低，群体间还没有形成互相隔离的遗传结构，鉴于此，在克氏原螯虾选育过程中，应以东平湖群体作为基础群体，并适当引进外地良种，以获得更多遗传多样性水平，促进克氏原螯虾养殖业的健康发展。
参考文献
[1]王卫民.软壳克氏原螯虾在我国开发利用前景[J].水生生物学报，1999，23（4）：375-381.
[2] 黄羽，戴银根，毕成武，等.长江中下游地区6个克氏原螯虾群体遗传多样性分析[J].南昌大学学报，2011，33（3）：243-247.
[3] 宋亮，韩晓磊，夏蝉，等.不同地区克氏原螯虾遗传多样性的AFLP分析[J].江苏农业学报，2012，28（2）：359-364.
[4] 王长忠，李忠，梁宏伟，等.长江下游地区4个克氏原螯虾群体的遗传多样性分析[J].生物多样性，2009，17（5）：518-523.
[5] 邢智珺，江虎成，陆伟，等.江苏8个克氏原螯虾群体遗传多样性微卫星分析[J].上海海洋大学学报，2014，23（5）：656-661.
[6] 韩晓磊，徐松维，李小蕊，等.克氏原螯虾群体遗传多样性的ISSR分析[J].江苏农业科学，2011，39（4）：26-29.
[7] 张龙岗，杨玲，刘羽清，等.山东克氏原螯虾3个地理群体遗传差异的RAPD 分析[J].长江大学学报，2014，11（17）：37-40.
[8] 张玮，阮龙，陈义红，等.克氏原螯虾4个地理群体遗传差异的RAPD分析[J].安徽农业科学，2010，38（22）：11861-11862，11876.
[9] 彭士明，施兆鸿，侯俊利，等.银鲳3个野生群体线粒体CO Ⅰ基因的序列差异分析[J].上海海洋大学学报，2009，18（4）：398-402.
[10] 马凌波，张凤英，乔振国，等.中国东南沿海青蟹线粒体CO Ⅰ基因部分序列分析[J].水产学报，2006，30（4）：463-467.
[11] 姜虎成，冯建彬，丁怀宇，等.淮河水系日本沼虾群体遗传结构和系统演化的线粒体CO Ⅰ序列分析[J].动物学杂志，2012，47（2）：73-84.
[12] 朱立静，陈淑吟，许晓风，等.四角蛤喇江苏群体线粒体CO Ⅰ基因片段序列研究[J].江苏农业科学，2010，38（4）：33-35，97.
[13] 张东亚，汪登强，刘绍平，等.怒江频危鱼类缺须盆唇鱼基于线粒体Cyt b 序列的群体遗传结构分析[J].中国水产科学，2009，16（4）：477-485.