【摘 要】
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目的 探讨重组慢病毒(lentivirus,LVs)介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4,HCN4)基因转染大
【机 构】
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泸州医学院附属医院心胸外科 四川泸州,646000
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目的 探讨重组慢病毒(lentivirus,LVs)介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4,HCN4)基因转染大鼠BMSCs构建生物起搏细胞的可行性. 方法 选取3～5周龄SD大鼠,采用改良全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs.以LVs作为转染载体,增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标记,构建LVs-HCN4-EGFP病毒液.取第3代BMSCs分别转染LVs-HCN4-EGFP病毒液(实验组)和LVs-EGFP空白病毒液(对照组),荧光显微镜观察转染24、48、72 h后两组绿色荧光表达情况,72 h时Western blot检测HCN4蛋白表达;电生理检测实验组转染72 h后BMSCs的起搏电流. 结果 实验组BMSCs形态正常、生长良好;48 h后荧光显微镜下可见散在的绿色荧光,转染效率约10％;72 h荧光表达稍增多,转染效率为20％～25％.对照组未见绿色荧光表达.Western blot检测示转染72 h后,实验组可见与HCN4蛋白相对分子质量相同的条带表达,而对照组仅有微弱表达;实验组蛋白条带灰度值为33.75±0.41,显著高于对照组的23.39±0.33(t=17.524,P=0.013).实验组转染后的BMSCs检测到起搏电流,并能被CsCl完全阻断,符合起搏电流特点. 结论 重组LVs介导HCN4基因成功转染大鼠BMSCs,并检测到HCN4蛋白表达及起搏电流.
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