论文部分内容阅读
【摘 要】 目的：了解泸州市β地中海贫血的基因突变类型及构成比，为本地区地中海贫血的诊断和预防提供理论依据。方法：采集114例β地中海贫血表型阳性儿童外周血，提取DNA，采用 PCR 联合反向点杂交法进行β-地贫基因突变位点分析。结果：114例β-地贫表型阳性儿童中，检测到β地贫基因突变者72例，共检出7种基因突变位点，其中以CD17（AAG﹥TAG）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD41-42（-TTCT）3种最为常见。基因突变组成15种基因型，包括52例杂合子、13例双重杂合子、3例三重杂合子和4例纯合子。结论：泸州地区儿童β地中海贫血检出率较高，应加强β地贫筛查，以做到及早诊断。
【关键词】 地中海贫血 基因突变 基因诊断 反向点杂交
地中海贫血（Thalassemia，简称地贫）是一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病，我国以广东、广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高。目前尚无有效的治疗方法，在全球7l%的国家被列为严重的健康问题[1]。本病具有高度的遗传异质性和极大的地域民族差异，不同地区人群的发病率和基因背景差异均很大，研究这些变化特征可为本病的预防及诊断提供科学依据。本课题通过分析泸州地区儿童β地中海贫血基因型，了解本地区引起该病的主要致病基因突变位点及构成比，探讨本地区β地贫基因类型的分布特征，从而为本地区地贫的基因診断及预防提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
病例来源为2011年1月至2013年6月泸州医学院附属医院儿科门诊（包括儿保门诊）及住院部就诊儿童。所有儿童均来自泸州市。
1.2 方法
1.2.1 血常规检测
所有标本均采用日本全自动Sysmex XT-2000i血细胞分析仪进行血常规分析。筛查出的血红蛋白（Hb）<110g/L， 红细胞平均容积（MCV）<80fl、红细胞平均血红蛋白（MCH）<27pg的小细胞低色素贫血患儿，进一步做血红蛋白电泳检测。
1.2.2 血红蛋白电泳检测
采用全自动琼脂糖凝胶 HLC -723G7型电泳仪分析系统进行检测。血红蛋白电泳检测结果中，MCV<80%，成人血红蛋白A2 （ HbA2） >3.2% 或胎儿血红蛋白（HbF）>3.1% 判为β地中海贫血表型阳性。
1.2.3 β地中海贫血基因检测
使用全血基因组DNA提取试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）提取样本的人基因组DNA。再经PCR扩增、杂交、显色后，参照试剂盒使用说明判读结果。
2 结果
2.1 β地贫基因诊断情况
2.1.1 检出β地中海贫血表型阳性者共114例，年龄1个月～14岁，其中住院病例41例，门诊病例73例；男66例，女48例；儿童初诊年龄最小5天，最大14岁，其中小于1岁者29例，1～3岁者45例，3岁以上者40例。
2.1.2 在进行地贫基因检查的114例儿童中，检测到β地贫基因突变者72例，占总检测对象的63.16%。
2 β地贫基因型和基因频率
2.1 共检出β-珠蛋白基因突变7种，分别为 CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD17（AAG﹥TAG）、-28（A﹥G）、CD71-72（+A）、βE（GAG→AAG）、-32（C﹥A）。其中以 CD17（AAG﹥TAG）、 IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、 CD41-42（-TTCT） 3种基因最为常见，占 90.22%。
β-地贫基因突变检测结果见表1。
2.2 基因突变组成15种基因型，包括52例杂合子（72.22% ）、13例双重杂合子（18.05%）、3例三重杂合子（4.17%）和4例纯合子（5.56%）。
2.2.1 杂合子基因型分别为： CD17（ 27.78% ）、IVS-Ⅱ-654（22.22% ）、CD41-42（19.44%） 和 -28（ 2.78% ）。
2.2.2 双重杂合子基因型分别为：IVS-Ⅱ-654/CD17（ 8.33%）、CD41-42/CD17（2.78%）、-28/ CD17（1.39%）、CD41-42 / CD71-72（1.39%）、CD41-42/βE（1.39%）、CD41-42/IVS-Ⅱ-654（1.39%）、CD41-42/-32（1.39%）。
2.2.3 三重杂合子基因型分别为： IVS-Ⅱ-654+CD17/-32（2.78%）、CD41-42 +IVS-Ⅱ-654 / -28（1.39%）。
2.2.4 纯合子基因型为： CD41-42/CD41-42 （2.78%）和 IVS-Ⅱ-654 / IVS-Ⅱ-654（ 2.78% ） 。β-地贫基因诊断情况见表2。
3 讨论
β地中海贫血基因基础及遗传方式均较明确，目前已发现360多种β珠蛋白基因突变类型，在中国人已发现的34种突变基因中，以下5种热突变最为多见，约占突变类型的90%：CD17（ A→T）、CD41/42 （-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（ C→T）、-28M（ A→G）和CD71-72（+A）[2]。
四川地区作为地贫高发地区亦有β地贫基因检测相关报道。李熙鸿等[3]通过检测27例重型β-地贫患儿及其父母共81例标本，发现最常见的3种基因突变分别是CD17（A→T）、CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（ C→T），基因构成比分别为43.6%、36.36%、14.54%。本研究结果与上述四川地区报道相符，同时与重庆、云南[4-5]有一定的相似性。而与广西、广东地区相比有所差异，广西玉林地区及广东佛山地区调查结果均显示以CD41-42（-TCTT） 最为多见[6-7]。考虑一方面本病地域及民族差异较大，另一方面与地区间人口之间相互迁徙交流有关。 本研究还检测出3例三重杂合子，其中同时检出IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD17（AAG﹥TAG）、 -32（C﹥A）3种基因突变者2例，另外1例检出的3种基因突变是CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）及-28（A﹥G）。关于β地贫三重杂合子相关报道较少，三重杂合子的出现大多是由于其父母一方为双重杂合子或纯合子，另一方为杂合子所组成。因此，可进一步对三重杂合子检出者的父母进行基因型分析加以证实。同时应强调对高危夫妇进行产前基因诊断，从而有效防止重型地贫患儿出生。
此外，研究结果中较高的检出率（72/114，63.16%）考虑与本研究采用的实验方法有关。陈红英等[8]通过分析50例β-地贫患儿基因检测结果，并与20例正常对照组儿童血常规红细胞参数进行对比，表明血常规参数（MCV、MCH 和RET等）可作为β-地贫的联合筛查指标。赵华等[9]研究证实血红蛋白电泳结合基因诊断对β地贫基因检测准确有效。本研究的实验方法则是在基因检测之前进行了红细胞参数检测、血红蛋白电泳检测两次筛查，结果中判为β地中海贫血表型阳性者再进一步完成β地贫基因检测，由此得出较高检出率。
地中海贫血目前尚无较好的根治方法，因而重在预防，目前最有效的手段可通过人群筛查、遗传咨询、婚前指导及产前基因诊断等以避免携带者联姻，防止病理基因扩散，控制地贫患儿出生[10]。本研究表明泸州地区儿童β地中海贫血检出率较高，应加强β地贫筛查，及早诊断。同时也应强调对高危夫妇进行产前基因诊断，为有效实施重型地贫患儿的出生干预提供理论依据。
參考文献
[1] Madell B，Darlison M.Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators[J].Bull World Health Organ，2008， 86： 480-487.
[2] 冯明，粟福曌，张清.琼脂糖凝胶电泳在地中海贫血产前筛查中的应用[J].广西医科大学学报，2012，29（3）：448-449.
[3] 李熙鸿，王晓阳，汪凤兰，等.四川地区重型β-地中海贫血患儿及双亲基因突变的研究[J].四川大学学报医学版，2004，35（3）：301-304.
[4] 杨夕，汪文明，安刚.南川地区地中海贫血基因分型的分析[J].国际检验医学杂志，2013，34（21）： 2830-2834.
[5] 杨跃煌，李翠莲，刘洪玉，等.41例地中海贫血患者的基因诊断与临床分析[J].中华妇幼临床医学杂志，2007，10（4）：67-69.
[6] 邓国生，罗宇迪，张宁，等.玉林地区地中海贫血基因缺失和点突变分布的探讨[J].中华全科医学，2011，9（1）：122-123.
[7] 余永雄，黄丽，陈唯.梧州地区β地中海贫血基因突变类型分析[J].现代预防医学，2013，40（4）：740-741.
[8] 陈红英，胡晓，刘文君.β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿血常规参数和基因检测结果分析[J].中国小儿血液与肿瘤杂志， 2011，16 （5）： 207 -209.
[9] 赵华，李代渝，何婧菁.血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血[J].泸州医学院学报，2012，35（3）： 291-293.
[10] Kalokairinou EM.The experience of beta-thalassaemia and its prevention in Cyprus[J]. Med Law，2007，26（ 2）：291-307.
【关键词】 地中海贫血 基因突变 基因诊断 反向点杂交
地中海贫血（Thalassemia，简称地贫）是一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病，我国以广东、广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高。目前尚无有效的治疗方法，在全球7l%的国家被列为严重的健康问题[1]。本病具有高度的遗传异质性和极大的地域民族差异，不同地区人群的发病率和基因背景差异均很大，研究这些变化特征可为本病的预防及诊断提供科学依据。本课题通过分析泸州地区儿童β地中海贫血基因型，了解本地区引起该病的主要致病基因突变位点及构成比，探讨本地区β地贫基因类型的分布特征，从而为本地区地贫的基因診断及预防提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
病例来源为2011年1月至2013年6月泸州医学院附属医院儿科门诊（包括儿保门诊）及住院部就诊儿童。所有儿童均来自泸州市。
1.2 方法
1.2.1 血常规检测
所有标本均采用日本全自动Sysmex XT-2000i血细胞分析仪进行血常规分析。筛查出的血红蛋白（Hb）<110g/L， 红细胞平均容积（MCV）<80fl、红细胞平均血红蛋白（MCH）<27pg的小细胞低色素贫血患儿，进一步做血红蛋白电泳检测。
1.2.2 血红蛋白电泳检测
采用全自动琼脂糖凝胶 HLC -723G7型电泳仪分析系统进行检测。血红蛋白电泳检测结果中，MCV<80%，成人血红蛋白A2 （ HbA2） >3.2% 或胎儿血红蛋白（HbF）>3.1% 判为β地中海贫血表型阳性。
1.2.3 β地中海贫血基因检测
使用全血基因组DNA提取试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）提取样本的人基因组DNA。再经PCR扩增、杂交、显色后，参照试剂盒使用说明判读结果。
2 结果
2.1 β地贫基因诊断情况
2.1.1 检出β地中海贫血表型阳性者共114例，年龄1个月～14岁，其中住院病例41例，门诊病例73例；男66例，女48例；儿童初诊年龄最小5天，最大14岁，其中小于1岁者29例，1～3岁者45例，3岁以上者40例。
2.1.2 在进行地贫基因检查的114例儿童中，检测到β地贫基因突变者72例，占总检测对象的63.16%。
2 β地贫基因型和基因频率
2.1 共检出β-珠蛋白基因突变7种，分别为 CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD17（AAG﹥TAG）、-28（A﹥G）、CD71-72（+A）、βE（GAG→AAG）、-32（C﹥A）。其中以 CD17（AAG﹥TAG）、 IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、 CD41-42（-TTCT） 3种基因最为常见，占 90.22%。
β-地贫基因突变检测结果见表1。
2.2 基因突变组成15种基因型，包括52例杂合子（72.22% ）、13例双重杂合子（18.05%）、3例三重杂合子（4.17%）和4例纯合子（5.56%）。
2.2.1 杂合子基因型分别为： CD17（ 27.78% ）、IVS-Ⅱ-654（22.22% ）、CD41-42（19.44%） 和 -28（ 2.78% ）。
2.2.2 双重杂合子基因型分别为：IVS-Ⅱ-654/CD17（ 8.33%）、CD41-42/CD17（2.78%）、-28/ CD17（1.39%）、CD41-42 / CD71-72（1.39%）、CD41-42/βE（1.39%）、CD41-42/IVS-Ⅱ-654（1.39%）、CD41-42/-32（1.39%）。
2.2.3 三重杂合子基因型分别为： IVS-Ⅱ-654+CD17/-32（2.78%）、CD41-42 +IVS-Ⅱ-654 / -28（1.39%）。
2.2.4 纯合子基因型为： CD41-42/CD41-42 （2.78%）和 IVS-Ⅱ-654 / IVS-Ⅱ-654（ 2.78% ） 。β-地贫基因诊断情况见表2。
3 讨论
β地中海贫血基因基础及遗传方式均较明确，目前已发现360多种β珠蛋白基因突变类型，在中国人已发现的34种突变基因中，以下5种热突变最为多见，约占突变类型的90%：CD17（ A→T）、CD41/42 （-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（ C→T）、-28M（ A→G）和CD71-72（+A）[2]。
四川地区作为地贫高发地区亦有β地贫基因检测相关报道。李熙鸿等[3]通过检测27例重型β-地贫患儿及其父母共81例标本，发现最常见的3种基因突变分别是CD17（A→T）、CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（ C→T），基因构成比分别为43.6%、36.36%、14.54%。本研究结果与上述四川地区报道相符，同时与重庆、云南[4-5]有一定的相似性。而与广西、广东地区相比有所差异，广西玉林地区及广东佛山地区调查结果均显示以CD41-42（-TCTT） 最为多见[6-7]。考虑一方面本病地域及民族差异较大，另一方面与地区间人口之间相互迁徙交流有关。 本研究还检测出3例三重杂合子，其中同时检出IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD17（AAG﹥TAG）、 -32（C﹥A）3种基因突变者2例，另外1例检出的3种基因突变是CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）及-28（A﹥G）。关于β地贫三重杂合子相关报道较少，三重杂合子的出现大多是由于其父母一方为双重杂合子或纯合子，另一方为杂合子所组成。因此，可进一步对三重杂合子检出者的父母进行基因型分析加以证实。同时应强调对高危夫妇进行产前基因诊断，从而有效防止重型地贫患儿出生。
此外，研究结果中较高的检出率（72/114，63.16%）考虑与本研究采用的实验方法有关。陈红英等[8]通过分析50例β-地贫患儿基因检测结果，并与20例正常对照组儿童血常规红细胞参数进行对比，表明血常规参数（MCV、MCH 和RET等）可作为β-地贫的联合筛查指标。赵华等[9]研究证实血红蛋白电泳结合基因诊断对β地贫基因检测准确有效。本研究的实验方法则是在基因检测之前进行了红细胞参数检测、血红蛋白电泳检测两次筛查，结果中判为β地中海贫血表型阳性者再进一步完成β地贫基因检测，由此得出较高检出率。
地中海贫血目前尚无较好的根治方法，因而重在预防，目前最有效的手段可通过人群筛查、遗传咨询、婚前指导及产前基因诊断等以避免携带者联姻，防止病理基因扩散，控制地贫患儿出生[10]。本研究表明泸州地区儿童β地中海贫血检出率较高，应加强β地贫筛查，及早诊断。同时也应强调对高危夫妇进行产前基因诊断，为有效实施重型地贫患儿的出生干预提供理论依据。
參考文献
[1] Madell B，Darlison M.Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators[J].Bull World Health Organ，2008， 86： 480-487.
[2] 冯明，粟福曌，张清.琼脂糖凝胶电泳在地中海贫血产前筛查中的应用[J].广西医科大学学报，2012，29（3）：448-449.
[3] 李熙鸿，王晓阳，汪凤兰，等.四川地区重型β-地中海贫血患儿及双亲基因突变的研究[J].四川大学学报医学版，2004，35（3）：301-304.
[4] 杨夕，汪文明，安刚.南川地区地中海贫血基因分型的分析[J].国际检验医学杂志，2013，34（21）： 2830-2834.
[5] 杨跃煌，李翠莲，刘洪玉，等.41例地中海贫血患者的基因诊断与临床分析[J].中华妇幼临床医学杂志，2007，10（4）：67-69.
[6] 邓国生，罗宇迪，张宁，等.玉林地区地中海贫血基因缺失和点突变分布的探讨[J].中华全科医学，2011，9（1）：122-123.
[7] 余永雄，黄丽，陈唯.梧州地区β地中海贫血基因突变类型分析[J].现代预防医学，2013，40（4）：740-741.
[8] 陈红英，胡晓，刘文君.β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿血常规参数和基因检测结果分析[J].中国小儿血液与肿瘤杂志， 2011，16 （5）： 207 -209.
[9] 赵华，李代渝，何婧菁.血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血[J].泸州医学院学报，2012，35（3）： 291-293.
[10] Kalokairinou EM.The experience of beta-thalassaemia and its prevention in Cyprus[J]. Med Law，2007，26（ 2）：291-307.