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【摘 要】 目的:了解泸州市β地中海贫血的基因突变类型及构成比,为本地区地中海贫血的诊断和预防提供理论依据。方法:采集114例β地中海贫血表型阳性儿童外周血,提取DNA,采用 PCR 联合反向点杂交法进行β-地贫基因突变位点分析。结果:114例β-地贫表型阳性儿童中,检测到β地贫基因突变者72例,共检出7种基因突变位点,其中以CD17(AAG﹥TAG)、IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、CD41-42(-TTCT)3种最为常见。基因突变组成15种基因型,包括52例杂合子、13例双重杂合子、3例三重杂合子和4例纯合子。结论:泸州地区儿童β地中海贫血检出率较高,应加强β地贫筛查,以做到及早诊断。
【关键词】 地中海贫血 基因突变 基因诊断 反向点杂交
地中海贫血(Thalassemia,简称地贫)是一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病,我国以广东、广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高。目前尚无有效的治疗方法,在全球7l%的国家被列为严重的健康问题[1]。本病具有高度的遗传异质性和极大的地域民族差异,不同地区人群的发病率和基因背景差异均很大,研究这些变化特征可为本病的预防及诊断提供科学依据。本课题通过分析泸州地区儿童β地中海贫血基因型,了解本地区引起该病的主要致病基因突变位点及构成比,探讨本地区β地贫基因类型的分布特征,从而为本地区地贫的基因診断及预防提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
病例来源为2011年1月至2013年6月泸州医学院附属医院儿科门诊(包括儿保门诊)及住院部就诊儿童。所有儿童均来自泸州市。
1.2 方法
1.2.1 血常规检测
所有标本均采用日本全自动Sysmex XT-2000i血细胞分析仪进行血常规分析。筛查出的血红蛋白(Hb)<110g/L, 红细胞平均容积(MCV)<80fl、红细胞平均血红蛋白(MCH)<27pg的小细胞低色素贫血患儿,进一步做血红蛋白电泳检测。
1.2.2 血红蛋白电泳检测
采用全自动琼脂糖凝胶 HLC -723G7型电泳仪分析系统进行检测。血红蛋白电泳检测结果中,MCV<80%,成人血红蛋白A2 ( HbA2) >3.2% 或胎儿血红蛋白(HbF)>3.1% 判为β地中海贫血表型阳性。
1.2.3 β地中海贫血基因检测
使用全血基因组DNA提取试剂盒(深圳亚能生物技术有限公司)提取样本的人基因组DNA。再经PCR扩增、杂交、显色后,参照试剂盒使用说明判读结果。
2 结果
2.1 β地贫基因诊断情况
2.1.1 检出β地中海贫血表型阳性者共114例,年龄1个月~14岁,其中住院病例41例,门诊病例73例;男66例,女48例;儿童初诊年龄最小5天,最大14岁,其中小于1岁者29例,1~3岁者45例,3岁以上者40例。
2.1.2 在进行地贫基因检查的114例儿童中,检测到β地贫基因突变者72例,占总检测对象的63.16%。
2 β地贫基因型和基因频率
2.1 共检出β-珠蛋白基因突变7种,分别为 CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、CD17(AAG﹥TAG)、-28(A﹥G)、CD71-72(+A)、βE(GAG→AAG)、-32(C﹥A)。其中以 CD17(AAG﹥TAG)、 IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、 CD41-42(-TTCT) 3种基因最为常见,占 90.22%。
β-地贫基因突变检测结果见表1。
2.2 基因突变组成15种基因型,包括52例杂合子(72.22% )、13例双重杂合子(18.05%)、3例三重杂合子(4.17%)和4例纯合子(5.56%)。
2.2.1 杂合子基因型分别为: CD17( 27.78% )、IVS-Ⅱ-654(22.22% )、CD41-42(19.44%) 和 -28( 2.78% )。
2.2.2 双重杂合子基因型分别为:IVS-Ⅱ-654/CD17( 8.33%)、CD41-42/CD17(2.78%)、-28/ CD17(1.39%)、CD41-42 / CD71-72(1.39%)、CD41-42/βE(1.39%)、CD41-42/IVS-Ⅱ-654(1.39%)、CD41-42/-32(1.39%)。
2.2.3 三重杂合子基因型分别为: IVS-Ⅱ-654+CD17/-32(2.78%)、CD41-42 +IVS-Ⅱ-654 / -28(1.39%)。
2.2.4 纯合子基因型为: CD41-42/CD41-42 (2.78%)和 IVS-Ⅱ-654 / IVS-Ⅱ-654( 2.78% ) 。β-地贫基因诊断情况见表2。
3 讨论
β地中海贫血基因基础及遗传方式均较明确,目前已发现360多种β珠蛋白基因突变类型,在中国人已发现的34种突变基因中,以下5种热突变最为多见,约占突变类型的90%:CD17( A→T)、CD41/42 (-TTCT)、IVS-Ⅱ-654( C→T)、-28M( A→G)和CD71-72(+A)[2]。
四川地区作为地贫高发地区亦有β地贫基因检测相关报道。李熙鸿等[3]通过检测27例重型β-地贫患儿及其父母共81例标本,发现最常见的3种基因突变分别是CD17(A→T)、CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654( C→T),基因构成比分别为43.6%、36.36%、14.54%。本研究结果与上述四川地区报道相符,同时与重庆、云南[4-5]有一定的相似性。而与广西、广东地区相比有所差异,广西玉林地区及广东佛山地区调查结果均显示以CD41-42(-TCTT) 最为多见[6-7]。考虑一方面本病地域及民族差异较大,另一方面与地区间人口之间相互迁徙交流有关。 本研究还检测出3例三重杂合子,其中同时检出IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、CD17(AAG﹥TAG)、 -32(C﹥A)3种基因突变者2例,另外1例检出的3种基因突变是CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C﹥T)及-28(A﹥G)。关于β地贫三重杂合子相关报道较少,三重杂合子的出现大多是由于其父母一方为双重杂合子或纯合子,另一方为杂合子所组成。因此,可进一步对三重杂合子检出者的父母进行基因型分析加以证实。同时应强调对高危夫妇进行产前基因诊断,从而有效防止重型地贫患儿出生。
此外,研究结果中较高的检出率(72/114,63.16%)考虑与本研究采用的实验方法有关。陈红英等[8]通过分析50例β-地贫患儿基因检测结果,并与20例正常对照组儿童血常规红细胞参数进行对比,表明血常规参数(MCV、MCH 和RET等)可作为β-地贫的联合筛查指标。赵华等[9]研究证实血红蛋白电泳结合基因诊断对β地贫基因检测准确有效。本研究的实验方法则是在基因检测之前进行了红细胞参数检测、血红蛋白电泳检测两次筛查,结果中判为β地中海贫血表型阳性者再进一步完成β地贫基因检测,由此得出较高检出率。
地中海贫血目前尚无较好的根治方法,因而重在预防,目前最有效的手段可通过人群筛查、遗传咨询、婚前指导及产前基因诊断等以避免携带者联姻,防止病理基因扩散,控制地贫患儿出生[10]。本研究表明泸州地区儿童β地中海贫血检出率较高,应加强β地贫筛查,及早诊断。同时也应强调对高危夫妇进行产前基因诊断,为有效实施重型地贫患儿的出生干预提供理论依据。
參考文献
[1] Madell B,Darlison M.Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators[J].Bull World Health Organ,2008, 86: 480-487.
[2] 冯明,粟福曌,张清.琼脂糖凝胶电泳在地中海贫血产前筛查中的应用[J].广西医科大学学报,2012,29(3):448-449.
[3] 李熙鸿,王晓阳,汪凤兰,等.四川地区重型β-地中海贫血患儿及双亲基因突变的研究[J].四川大学学报医学版,2004,35(3):301-304.
[4] 杨夕,汪文明,安刚.南川地区地中海贫血基因分型的分析[J].国际检验医学杂志,2013,34(21): 2830-2834.
[5] 杨跃煌,李翠莲,刘洪玉,等.41例地中海贫血患者的基因诊断与临床分析[J].中华妇幼临床医学杂志,2007,10(4):67-69.
[6] 邓国生,罗宇迪,张宁,等.玉林地区地中海贫血基因缺失和点突变分布的探讨[J].中华全科医学,2011,9(1):122-123.
[7] 余永雄,黄丽,陈唯.梧州地区β地中海贫血基因突变类型分析[J].现代预防医学,2013,40(4):740-741.
[8] 陈红英,胡晓,刘文君.β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿血常规参数和基因检测结果分析[J].中国小儿血液与肿瘤杂志, 2011,16 (5): 207 -209.
[9] 赵华,李代渝,何婧菁.血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血[J].泸州医学院学报,2012,35(3): 291-293.
[10] Kalokairinou EM.The experience of beta-thalassaemia and its prevention in Cyprus[J]. Med Law,2007,26( 2):291-307.
【关键词】 地中海贫血 基因突变 基因诊断 反向点杂交
地中海贫血(Thalassemia,简称地贫)是一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病,我国以广东、广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高。目前尚无有效的治疗方法,在全球7l%的国家被列为严重的健康问题[1]。本病具有高度的遗传异质性和极大的地域民族差异,不同地区人群的发病率和基因背景差异均很大,研究这些变化特征可为本病的预防及诊断提供科学依据。本课题通过分析泸州地区儿童β地中海贫血基因型,了解本地区引起该病的主要致病基因突变位点及构成比,探讨本地区β地贫基因类型的分布特征,从而为本地区地贫的基因診断及预防提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
病例来源为2011年1月至2013年6月泸州医学院附属医院儿科门诊(包括儿保门诊)及住院部就诊儿童。所有儿童均来自泸州市。
1.2 方法
1.2.1 血常规检测
所有标本均采用日本全自动Sysmex XT-2000i血细胞分析仪进行血常规分析。筛查出的血红蛋白(Hb)<110g/L, 红细胞平均容积(MCV)<80fl、红细胞平均血红蛋白(MCH)<27pg的小细胞低色素贫血患儿,进一步做血红蛋白电泳检测。
1.2.2 血红蛋白电泳检测
采用全自动琼脂糖凝胶 HLC -723G7型电泳仪分析系统进行检测。血红蛋白电泳检测结果中,MCV<80%,成人血红蛋白A2 ( HbA2) >3.2% 或胎儿血红蛋白(HbF)>3.1% 判为β地中海贫血表型阳性。
1.2.3 β地中海贫血基因检测
使用全血基因组DNA提取试剂盒(深圳亚能生物技术有限公司)提取样本的人基因组DNA。再经PCR扩增、杂交、显色后,参照试剂盒使用说明判读结果。
2 结果
2.1 β地贫基因诊断情况
2.1.1 检出β地中海贫血表型阳性者共114例,年龄1个月~14岁,其中住院病例41例,门诊病例73例;男66例,女48例;儿童初诊年龄最小5天,最大14岁,其中小于1岁者29例,1~3岁者45例,3岁以上者40例。
2.1.2 在进行地贫基因检查的114例儿童中,检测到β地贫基因突变者72例,占总检测对象的63.16%。
2 β地贫基因型和基因频率
2.1 共检出β-珠蛋白基因突变7种,分别为 CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、CD17(AAG﹥TAG)、-28(A﹥G)、CD71-72(+A)、βE(GAG→AAG)、-32(C﹥A)。其中以 CD17(AAG﹥TAG)、 IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、 CD41-42(-TTCT) 3种基因最为常见,占 90.22%。
β-地贫基因突变检测结果见表1。
2.2 基因突变组成15种基因型,包括52例杂合子(72.22% )、13例双重杂合子(18.05%)、3例三重杂合子(4.17%)和4例纯合子(5.56%)。
2.2.1 杂合子基因型分别为: CD17( 27.78% )、IVS-Ⅱ-654(22.22% )、CD41-42(19.44%) 和 -28( 2.78% )。
2.2.2 双重杂合子基因型分别为:IVS-Ⅱ-654/CD17( 8.33%)、CD41-42/CD17(2.78%)、-28/ CD17(1.39%)、CD41-42 / CD71-72(1.39%)、CD41-42/βE(1.39%)、CD41-42/IVS-Ⅱ-654(1.39%)、CD41-42/-32(1.39%)。
2.2.3 三重杂合子基因型分别为: IVS-Ⅱ-654+CD17/-32(2.78%)、CD41-42 +IVS-Ⅱ-654 / -28(1.39%)。
2.2.4 纯合子基因型为: CD41-42/CD41-42 (2.78%)和 IVS-Ⅱ-654 / IVS-Ⅱ-654( 2.78% ) 。β-地贫基因诊断情况见表2。
3 讨论
β地中海贫血基因基础及遗传方式均较明确,目前已发现360多种β珠蛋白基因突变类型,在中国人已发现的34种突变基因中,以下5种热突变最为多见,约占突变类型的90%:CD17( A→T)、CD41/42 (-TTCT)、IVS-Ⅱ-654( C→T)、-28M( A→G)和CD71-72(+A)[2]。
四川地区作为地贫高发地区亦有β地贫基因检测相关报道。李熙鸿等[3]通过检测27例重型β-地贫患儿及其父母共81例标本,发现最常见的3种基因突变分别是CD17(A→T)、CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654( C→T),基因构成比分别为43.6%、36.36%、14.54%。本研究结果与上述四川地区报道相符,同时与重庆、云南[4-5]有一定的相似性。而与广西、广东地区相比有所差异,广西玉林地区及广东佛山地区调查结果均显示以CD41-42(-TCTT) 最为多见[6-7]。考虑一方面本病地域及民族差异较大,另一方面与地区间人口之间相互迁徙交流有关。 本研究还检测出3例三重杂合子,其中同时检出IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、CD17(AAG﹥TAG)、 -32(C﹥A)3种基因突变者2例,另外1例检出的3种基因突变是CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C﹥T)及-28(A﹥G)。关于β地贫三重杂合子相关报道较少,三重杂合子的出现大多是由于其父母一方为双重杂合子或纯合子,另一方为杂合子所组成。因此,可进一步对三重杂合子检出者的父母进行基因型分析加以证实。同时应强调对高危夫妇进行产前基因诊断,从而有效防止重型地贫患儿出生。
此外,研究结果中较高的检出率(72/114,63.16%)考虑与本研究采用的实验方法有关。陈红英等[8]通过分析50例β-地贫患儿基因检测结果,并与20例正常对照组儿童血常规红细胞参数进行对比,表明血常规参数(MCV、MCH 和RET等)可作为β-地贫的联合筛查指标。赵华等[9]研究证实血红蛋白电泳结合基因诊断对β地贫基因检测准确有效。本研究的实验方法则是在基因检测之前进行了红细胞参数检测、血红蛋白电泳检测两次筛查,结果中判为β地中海贫血表型阳性者再进一步完成β地贫基因检测,由此得出较高检出率。
地中海贫血目前尚无较好的根治方法,因而重在预防,目前最有效的手段可通过人群筛查、遗传咨询、婚前指导及产前基因诊断等以避免携带者联姻,防止病理基因扩散,控制地贫患儿出生[10]。本研究表明泸州地区儿童β地中海贫血检出率较高,应加强β地贫筛查,及早诊断。同时也应强调对高危夫妇进行产前基因诊断,为有效实施重型地贫患儿的出生干预提供理论依据。
參考文献
[1] Madell B,Darlison M.Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators[J].Bull World Health Organ,2008, 86: 480-487.
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[8] 陈红英,胡晓,刘文君.β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿血常规参数和基因检测结果分析[J].中国小儿血液与肿瘤杂志, 2011,16 (5): 207 -209.
[9] 赵华,李代渝,何婧菁.血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血[J].泸州医学院学报,2012,35(3): 291-293.
[10] Kalokairinou EM.The experience of beta-thalassaemia and its prevention in Cyprus[J]. Med Law,2007,26( 2):291-307.