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[摘 要]目的 建立测定结核灵片中狼毒乙素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent HCC18，流动相为甲醇水（体积比70∶30），流速1.0mL/min，检测波长291nm，柱温为室温。结果 狼毒乙素质量浓度在0.606～7.278μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 8；平均回收率为100. 20%，RSD为0.29%（n=6）。结论 本方法简便、准确，可用于测定结核灵片中狼毒乙素的含量。
[关键词]结核灵片 狼毒乙素 HPLC
中图分类号：R97文献标识码：A文章编号：1009-914X（2013）17-196-01
结核灵片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十三册中，由狼毒药材（大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata 及狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的根）经煎煮提纯而成，主治淋巴结核，对肺结核及其他淋巴结核亦有疗效。该标准采用紫外分光光度法测定结核灵片中的狼毒乙素含量。本文建立了高效液相色谱法的外标法，结果表明本文方法简便、准确、可靠，可作为该制剂的含量测定方法。
1 仪器与试药
SHIMADZU岛津LC 2010A高效液相色谱仪，CLASS VP色谱数据工作站；SartoriusBP211D电子分析天平；JL 180DTH超声波清洗器。
结核灵片（江门市恒健药业有限公司提供，批号：070701、071101、080201、080501、080801、081001）。狼毒乙素对照品（由江西万基药物研究院有限责任公司提供，纯度≥99.9%，批号：46113 0601）；甲醇（天津四友，色谱纯）；水为双蒸馏水（自制），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
取结核灵片20片，精密称定总质量，求得平均片质量，研细至粉末，取约1 g，精密称定，置50mL量瓶中，加水5mL，振摇使成稠膏，加入甲醇35mL，摇匀，超声20min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2 阴性样品的制备
用密度为1.32～1.36（60～65 ℃）的淀粉浆代替清膏，按结核灵片的生产工艺及供试品溶液的制备方法制备，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取狼毒乙素对照品0.012 13 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为狼毒乙素对照品储备液（121.3 μg/mL）。再精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为狼毒乙素对照品溶液（2.426μg/mL）。
2.4 色谱条件
色谱柱为Agilent HCC18（4.6 mm×250 mm，5μm，安捷科技公司）；柱温室温；流动相为甲醇水（体积比70∶30）；流速为1.0mL/min；检测波长为291nm，进样量为20μL；在该色谱条件下，理论板数按狼毒乙素计算大于2000，狼毒乙素与杂质峰可达基线分离，分离度大于1.5。
2.5 标准曲线的绘制
分别精密吸取上述对照品储备液（121.3μg/mL）0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分别置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.606、1.213、2.426、4.852、7.278μg/mL的系列溶液。分别精密吸取20 μL进样，按上述色谱条件测定，记录色谱图。以狼毒乙素质量浓度（ρ）为横坐标，狼毒乙素峰面积（A）为纵坐标作图，得回归方程：A=158577ρ-5459.2，r=0. 999 8（n=5）。結果表明狼毒乙素质量浓度在0.606～7.278μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
2.6 重复性试验
取同一批结核灵片（批号070701），按“2.1”项下制备方法平行制备6份供试品溶液，分别依法进样，测得峰面积并计算含量，结果测得平均含量为0. 01439%，RSD为0.34%。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液20 μL，分别在0、2、5、7、10、12 h进样，共测5次，结果测得狼毒乙素含量的RSD值为0.31%，表明供试品溶液在12 h内测定稳定。
2.8 回收率试验
取同一批结核灵片（批号070701） 粉末1 g，精密称定，共6份，分别置50 mL量瓶中，精密加入狼毒乙素对照品储备液（121.3μg/mL）2 mL，按“2.1”项下方法制备溶液，并进样测定，计算平均回收率为100.20%， RSD为0.29%（n=6）。
2.9 含量测定及含量限度
分别精密称定6批结核灵片各3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法进样测定。因狼毒是毒性中药材，有必要确定含量限度，建议每片结核灵片含狼毒乙素为0.0288～0.0432mg/片。
3 讨论
3.1 狼毒药材的化学成分主要包括黄酮、二萜、香豆素类等，其中狼毒乙素对结核杆菌有明显的抑制作用，因此选择狼毒乙素作为结核灵片含量测定的指标成分。
3.2 曾以甲醇作溶剂，但提取效果不理想；也尝试用流动相作溶剂，提取效果理想，但狼毒乙素受结核灵片中的其他成分干扰，达不到良好的分离效果。
3.3 实验中还考察了不同柱温（10、20、30、40 ℃）对色谱分离效果的影响，结果各柱温对分离效果、保留时间的影响无明显区别，因此确定以柱温为室温。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂（第十三册）[M].北京：化学工业出版社，1997：160.
[2] 董钰明，李海燕. 中药狼毒化学成分、药理作用及有效成分含量测定的研究概况[J/OL].
[关键词]结核灵片 狼毒乙素 HPLC
中图分类号：R97文献标识码：A文章编号：1009-914X（2013）17-196-01
结核灵片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十三册中，由狼毒药材（大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata 及狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的根）经煎煮提纯而成，主治淋巴结核，对肺结核及其他淋巴结核亦有疗效。该标准采用紫外分光光度法测定结核灵片中的狼毒乙素含量。本文建立了高效液相色谱法的外标法，结果表明本文方法简便、准确、可靠，可作为该制剂的含量测定方法。
1 仪器与试药
SHIMADZU岛津LC 2010A高效液相色谱仪，CLASS VP色谱数据工作站；SartoriusBP211D电子分析天平；JL 180DTH超声波清洗器。
结核灵片（江门市恒健药业有限公司提供，批号：070701、071101、080201、080501、080801、081001）。狼毒乙素对照品（由江西万基药物研究院有限责任公司提供，纯度≥99.9%，批号：46113 0601）；甲醇（天津四友，色谱纯）；水为双蒸馏水（自制），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
取结核灵片20片，精密称定总质量，求得平均片质量，研细至粉末，取约1 g，精密称定，置50mL量瓶中，加水5mL，振摇使成稠膏，加入甲醇35mL，摇匀，超声20min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2 阴性样品的制备
用密度为1.32～1.36（60～65 ℃）的淀粉浆代替清膏，按结核灵片的生产工艺及供试品溶液的制备方法制备，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取狼毒乙素对照品0.012 13 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为狼毒乙素对照品储备液（121.3 μg/mL）。再精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为狼毒乙素对照品溶液（2.426μg/mL）。
2.4 色谱条件
色谱柱为Agilent HCC18（4.6 mm×250 mm，5μm，安捷科技公司）；柱温室温；流动相为甲醇水（体积比70∶30）；流速为1.0mL/min；检测波长为291nm，进样量为20μL；在该色谱条件下，理论板数按狼毒乙素计算大于2000，狼毒乙素与杂质峰可达基线分离，分离度大于1.5。
2.5 标准曲线的绘制
分别精密吸取上述对照品储备液（121.3μg/mL）0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分别置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.606、1.213、2.426、4.852、7.278μg/mL的系列溶液。分别精密吸取20 μL进样，按上述色谱条件测定，记录色谱图。以狼毒乙素质量浓度（ρ）为横坐标，狼毒乙素峰面积（A）为纵坐标作图，得回归方程：A=158577ρ-5459.2，r=0. 999 8（n=5）。結果表明狼毒乙素质量浓度在0.606～7.278μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
2.6 重复性试验
取同一批结核灵片（批号070701），按“2.1”项下制备方法平行制备6份供试品溶液，分别依法进样，测得峰面积并计算含量，结果测得平均含量为0. 01439%，RSD为0.34%。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液20 μL，分别在0、2、5、7、10、12 h进样，共测5次，结果测得狼毒乙素含量的RSD值为0.31%，表明供试品溶液在12 h内测定稳定。
2.8 回收率试验
取同一批结核灵片（批号070701） 粉末1 g，精密称定，共6份，分别置50 mL量瓶中，精密加入狼毒乙素对照品储备液（121.3μg/mL）2 mL，按“2.1”项下方法制备溶液，并进样测定，计算平均回收率为100.20%， RSD为0.29%（n=6）。
2.9 含量测定及含量限度
分别精密称定6批结核灵片各3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法进样测定。因狼毒是毒性中药材，有必要确定含量限度，建议每片结核灵片含狼毒乙素为0.0288～0.0432mg/片。
3 讨论
3.1 狼毒药材的化学成分主要包括黄酮、二萜、香豆素类等，其中狼毒乙素对结核杆菌有明显的抑制作用，因此选择狼毒乙素作为结核灵片含量测定的指标成分。
3.2 曾以甲醇作溶剂，但提取效果不理想；也尝试用流动相作溶剂，提取效果理想，但狼毒乙素受结核灵片中的其他成分干扰，达不到良好的分离效果。
3.3 实验中还考察了不同柱温（10、20、30、40 ℃）对色谱分离效果的影响，结果各柱温对分离效果、保留时间的影响无明显区别，因此确定以柱温为室温。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂（第十三册）[M].北京：化学工业出版社，1997：160.
[2] 董钰明，李海燕. 中药狼毒化学成分、药理作用及有效成分含量测定的研究概况[J/OL].