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摘要：麦角固醇是真菌和一些藻类细胞膜中的主要固醇类物质，真菌死亡后迅速分解，因此它的含量能够用来表征土壤真菌的活性。由于麦角固醇受土壤真菌种类及其生长环境的影响显著且较易被分解，因此建立一种简单、快速、准确的测定麦角固醇含量的方法尤为重要。比较KOH-醇溶液提取法和正己烷-异丙醇提取法2种不同测定方法发现，不通过皂化处理不但不会影响测定的准确率，而且还会大大缩短提取时间，减小提取过程中麦角固醇的损失，从而显著提高回收率。同时，麦角固醇测定方法的回收率被证实与土壤样品水土比之间存在显著的负相关关系（r=-0943，P<0.05）。
关键词：土壤；真菌；麦角固醇；高效液相色谱；测定方法；KOH-醇溶液提取法；正己烷-异丙醇提取法
中图分类号： S154.3文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）04-0153-03
现在用以描述土壤微生物生物量的相关方法很多，但大多用于估计总土壤微生物生物量（如熏蒸浸提法、底物诱导呼吸法）或者用作表征土壤微生物功能多样性（如Biolog微平板法[1]）。而传统的微生物平板纯培养方法测定的土壤微生物类群数量只占到土壤中实际存在微生物总数的1%～10%[2]。此外，磷脂脂肪酸分析方法（PLFA方法）虽然可以根据微生物细胞膜磷脂酸的种类和数量来判定微生物的多样性，并定量反映可繁殖或有潜在繁殖能力的不同类群微生物生物量和总生物量[3]，但是此方法最适合作总微生物群分析，而非专一的微生物种类的研究[4]，且其对特殊仪器设备的要求和复杂的试验方法限制了它的应用[5]。麦角固醇是大多数子囊菌类、担子菌类等真菌细胞膜中的重要组成成分[6]，其结构如图1所示。由于真菌死亡后麦角固醇迅速分解，从而其相对含量可以作为真菌活性的优良指标[7-12]，该方法对仪器设备要求不高、试验步骤简单，利用麦角固醇表征真菌活性优于传统的微生物平板计数法，它能更方便、快速、真实地反映真菌活性[13-16]。本研究是探讨土壤中麦角固醇含量的测定方法，筛选出2种较为合理的测定方法，并通过这2种测定方法的比较以期为研究土壤真菌提供技术手段。
1材料与方法
供试土样采自江西省红壤研究所（116°26′E、28°37′N）
[FK（W9][TPQJ1.tif][FK）]
内的水稻地，土样采集深度为0～10 cm的耕层土壤，用自封袋密封带回实验室，挑去植物残根和石块，过2 mm筛，4 ℃冰箱保存，供分析用。
1.1测定方法一
KOH-醇溶液提取法。
1.1.1仪器
高效液相色谱仪（岛津，日本）、紫外检测器、旋转蒸发仪。
1.1.2试剂
甲醇（色谱级）、乙醇（分析纯）、環己烷（分析纯），麦角固醇标准样品。
1.1.3色谱条件
色谱柱为CLC-ODS反相柱（150 mm×6 mm），流动相为100%甲醇，流速为1.5 mL/min，检测波长为283 nm，采用外标法按峰面积进行定量。
1.1.4样品处理
根据土壤有机质含量称取1～3 g鲜土，加入20 mL KOH-醇溶液（甲醇 ∶[KG-*3]乙醇=1 ∶[KG-*3]3），漩涡振荡，然后在水浴锅中75 ℃皂化1 h，冷却至室温，再加入5 mL双蒸水，离心，上清液转入分液漏斗中，加25 mL环己烷，萃取、分液，将上层环己烷溶液转移至浓缩瓶中，用旋转蒸发仪 40 ℃ 条件下蒸干，用甲醇洗浓缩瓶并定容于1 mL容量瓶中待测。
1.2测定方法二
正己烷-异丙醇提取法。
1.2.1仪器
高效液相色谱仪（岛津，日本）、紫外检测器。
1.2.2试剂
甲醇、乙醇、正己烷、异丙醇，所有试剂均为色谱级。
1.2.3色谱条件
色谱柱为Phenomenex Luna silica正相柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为正己烷和异丙醇混合物（体积比98 ∶[KG-*3]2）、流速为1.5 mL/min，检测波长282 nm，采用外标法按峰面积进行定量。
1.2.4样品处理
根据土壤有机质含量称取相当于0.2 g干土的鲜土于2 mL离心管中，加入400 μL甲醇和乙醇的混合液（体积比4 ∶[KG-*3]1 ），放在4 ℃条件下培养2 h，再加入1 mL正己烷和异丙醇的混合液（体积比98 ∶[KG-*3]2），漩涡振荡，13 000 r/min 离心 2 min，将上层溶液过0.2 μm微孔滤膜，转入进样瓶中，上机前保存在-20 ℃冰箱中。
2结果与分析
2.1标准曲线
2.1.1方法一的标准曲线
精确称取100 mg麦角固醇对照品，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液。用标准贮备液分别配制0.000 8、0.002、0.004、0.008、0.02、0.04 mg/mL 等6份标液，在已建立的色谱条件下进样 10 μL，以峰面积A为横坐标、标准样品浓度C为纵坐标作标准曲线，进行回归处理（图4）。
[CM（24]由图4可以看出，方法一测定的土壤中麦角固醇含量的
标准曲线相关性很好（r2=0.999，P<0.05），因此用该方法测得的土壤中麦角固醇含量的数据是可信的。
2.1.2方法二的标准曲线
精确称取100 mg麦角固醇对照品，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液。用标准贮备液分别配制0.001、0.002、0.0034、0.006、0.008、0.01 mg/mL 等6份标液，在已建立的色谱条件下进样1 μL，以峰面积A为横坐标、标准样品浓度C为纵坐标作标准曲线，进行回归处理（图5）。 [CM（24]由圖5可以看出，方法二测定的麦角固醇含量的标准曲
线相关性很好（r2=0.999，P<0.05），因此用该方法测得的土壤中麦角固醇含量的数据是可信的。
2.2回收率
精确移取0.002、0.008 mg/mL麦角固醇标准样品1 mL于相当于0.2 g干土的鲜土样品中，然后按提取步骤操作，并采用外标法按峰面积计算出总麦角固醇质量m和土壤样品中麦角固醇质量的本底值，然后按照下面的计算方法得出回收率：
[JZ]回收率=[SX（]m-m0C×V[SX）]×100%。
式中：m为总的麦角固醇质量，mg；m0为土壤样品中麦角固醇质量的本底值，mg；C为麦角固醇标准样品的浓度，mg/mL；V为移取麦角固醇标准样品的体积，mL。
由表1可以看出，利用方法二测定的土壤中麦角固醇含量的回收率比方法一高约105%，且相对标准差（RSD）比方法一低。因此，利用方法二测定土壤中麦角固醇含量更合理。
2.3麦角固醇含量与土壤样品的水土质量比之间的关系
由于麦角固醇容易分解，所以在测定样品时须要同时计算回收率。由图6可以看出，麦角固醇含量与样品的水土质量比之间呈显著负相关关系（r=-0.943，P<0.05）。
2.42种方法优劣分析
由于方法一的提取过程包括皂化、萃取、浓缩3个步骤，皂化过程需时较多，用分液漏斗萃取和旋转蒸发仪浓缩不仅用时多，而且麦角固醇容易损失掉，这是该方法最大的缺点。方法二则省去了皂化和浓缩过程，大大缩短了提取时间，提高了回收率，且相对标准差较小；但是，该方法色谱柱用的是正相柱，基线不容易稳定。
3结论与讨论
经反复测定，方法二提取步骤简单、耗时短、回收率高、同一样品测定值稳定，比方法一更适用。这是因为方法二省去了皂化和浓缩过程，从而大大缩短了提取时间；而且由于麦角固醇极易分解，缩短了提取时间，这也会减小提取过程中麦角固醇的损失。提取过程中需要注意的是，由于麦角固醇容易分解，提取时避免让样品长时间暴露在空气中，尽量随时提取随时上机测定，并在测定样品的同时测定回收率。
[HS2*3][HT8.5H]参考文献：
[1]Mccaig A，Grayston S，Prosser J，et al. Impact of cultivation on characterisation of species composition of soil bacterial communities[J]. FEMS Microbiology Ecology，2001，35（1）：37-48.
[2]Borneman J，Skroch P，Osullivan K，et al. Molecular microbial diversity of an agricultural soil in Wisconsin[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，62（6）：1935-1943.
[3]王曙光，侯彦林. 磷脂脂肪酸方法在土壤微生物分析中的应用[J]. 微生物学通报，2004，31（1）：114-117.
[4]van Elsas J D，Duarte G F，Rosado A S，et al. Microbiological and molecular biological methods for monitoring microbial inoculants and their effects in the soil environment[J]. Mcrobiol Meth，1998，32：133-154.
[5]张汉波，段昌群，屈良鹄. 非培养方法在土壤微生物生态学研究中的应用[J]. 生态学杂志，2003，22（5）：131-136.
[6]Ruzicka S，Edgerton D，Norman M，et al. The utility of ergosterol as a bioindicator of fungi in temperate soils[J]. Soil Biology
关键词：土壤；真菌；麦角固醇；高效液相色谱；测定方法；KOH-醇溶液提取法；正己烷-异丙醇提取法
中图分类号： S154.3文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）04-0153-03
现在用以描述土壤微生物生物量的相关方法很多，但大多用于估计总土壤微生物生物量（如熏蒸浸提法、底物诱导呼吸法）或者用作表征土壤微生物功能多样性（如Biolog微平板法[1]）。而传统的微生物平板纯培养方法测定的土壤微生物类群数量只占到土壤中实际存在微生物总数的1%～10%[2]。此外，磷脂脂肪酸分析方法（PLFA方法）虽然可以根据微生物细胞膜磷脂酸的种类和数量来判定微生物的多样性，并定量反映可繁殖或有潜在繁殖能力的不同类群微生物生物量和总生物量[3]，但是此方法最适合作总微生物群分析，而非专一的微生物种类的研究[4]，且其对特殊仪器设备的要求和复杂的试验方法限制了它的应用[5]。麦角固醇是大多数子囊菌类、担子菌类等真菌细胞膜中的重要组成成分[6]，其结构如图1所示。由于真菌死亡后麦角固醇迅速分解，从而其相对含量可以作为真菌活性的优良指标[7-12]，该方法对仪器设备要求不高、试验步骤简单，利用麦角固醇表征真菌活性优于传统的微生物平板计数法，它能更方便、快速、真实地反映真菌活性[13-16]。本研究是探讨土壤中麦角固醇含量的测定方法，筛选出2种较为合理的测定方法，并通过这2种测定方法的比较以期为研究土壤真菌提供技术手段。
1材料与方法
供试土样采自江西省红壤研究所（116°26′E、28°37′N）
[FK（W9][TPQJ1.tif][FK）]
内的水稻地，土样采集深度为0～10 cm的耕层土壤，用自封袋密封带回实验室，挑去植物残根和石块，过2 mm筛，4 ℃冰箱保存，供分析用。
1.1测定方法一
KOH-醇溶液提取法。
1.1.1仪器
高效液相色谱仪（岛津，日本）、紫外检测器、旋转蒸发仪。
1.1.2试剂
甲醇（色谱级）、乙醇（分析纯）、環己烷（分析纯），麦角固醇标准样品。
1.1.3色谱条件
色谱柱为CLC-ODS反相柱（150 mm×6 mm），流动相为100%甲醇，流速为1.5 mL/min，检测波长为283 nm，采用外标法按峰面积进行定量。
1.1.4样品处理
根据土壤有机质含量称取1～3 g鲜土，加入20 mL KOH-醇溶液（甲醇 ∶[KG-*3]乙醇=1 ∶[KG-*3]3），漩涡振荡，然后在水浴锅中75 ℃皂化1 h，冷却至室温，再加入5 mL双蒸水，离心，上清液转入分液漏斗中，加25 mL环己烷，萃取、分液，将上层环己烷溶液转移至浓缩瓶中，用旋转蒸发仪 40 ℃ 条件下蒸干，用甲醇洗浓缩瓶并定容于1 mL容量瓶中待测。
1.2测定方法二
正己烷-异丙醇提取法。
1.2.1仪器
高效液相色谱仪（岛津，日本）、紫外检测器。
1.2.2试剂
甲醇、乙醇、正己烷、异丙醇，所有试剂均为色谱级。
1.2.3色谱条件
色谱柱为Phenomenex Luna silica正相柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为正己烷和异丙醇混合物（体积比98 ∶[KG-*3]2）、流速为1.5 mL/min，检测波长282 nm，采用外标法按峰面积进行定量。
1.2.4样品处理
根据土壤有机质含量称取相当于0.2 g干土的鲜土于2 mL离心管中，加入400 μL甲醇和乙醇的混合液（体积比4 ∶[KG-*3]1 ），放在4 ℃条件下培养2 h，再加入1 mL正己烷和异丙醇的混合液（体积比98 ∶[KG-*3]2），漩涡振荡，13 000 r/min 离心 2 min，将上层溶液过0.2 μm微孔滤膜，转入进样瓶中，上机前保存在-20 ℃冰箱中。
2结果与分析
2.1标准曲线
2.1.1方法一的标准曲线
精确称取100 mg麦角固醇对照品，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液。用标准贮备液分别配制0.000 8、0.002、0.004、0.008、0.02、0.04 mg/mL 等6份标液，在已建立的色谱条件下进样 10 μL，以峰面积A为横坐标、标准样品浓度C为纵坐标作标准曲线，进行回归处理（图4）。
[CM（24]由图4可以看出，方法一测定的土壤中麦角固醇含量的
标准曲线相关性很好（r2=0.999，P<0.05），因此用该方法测得的土壤中麦角固醇含量的数据是可信的。
2.1.2方法二的标准曲线
精确称取100 mg麦角固醇对照品，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液。用标准贮备液分别配制0.001、0.002、0.0034、0.006、0.008、0.01 mg/mL 等6份标液，在已建立的色谱条件下进样1 μL，以峰面积A为横坐标、标准样品浓度C为纵坐标作标准曲线，进行回归处理（图5）。 [CM（24]由圖5可以看出，方法二测定的麦角固醇含量的标准曲
线相关性很好（r2=0.999，P<0.05），因此用该方法测得的土壤中麦角固醇含量的数据是可信的。
2.2回收率
精确移取0.002、0.008 mg/mL麦角固醇标准样品1 mL于相当于0.2 g干土的鲜土样品中，然后按提取步骤操作，并采用外标法按峰面积计算出总麦角固醇质量m和土壤样品中麦角固醇质量的本底值，然后按照下面的计算方法得出回收率：
[JZ]回收率=[SX（]m-m0C×V[SX）]×100%。
式中：m为总的麦角固醇质量，mg；m0为土壤样品中麦角固醇质量的本底值，mg；C为麦角固醇标准样品的浓度，mg/mL；V为移取麦角固醇标准样品的体积，mL。
由表1可以看出，利用方法二测定的土壤中麦角固醇含量的回收率比方法一高约105%，且相对标准差（RSD）比方法一低。因此，利用方法二测定土壤中麦角固醇含量更合理。
2.3麦角固醇含量与土壤样品的水土质量比之间的关系
由于麦角固醇容易分解，所以在测定样品时须要同时计算回收率。由图6可以看出，麦角固醇含量与样品的水土质量比之间呈显著负相关关系（r=-0.943，P<0.05）。
2.42种方法优劣分析
由于方法一的提取过程包括皂化、萃取、浓缩3个步骤，皂化过程需时较多，用分液漏斗萃取和旋转蒸发仪浓缩不仅用时多，而且麦角固醇容易损失掉，这是该方法最大的缺点。方法二则省去了皂化和浓缩过程，大大缩短了提取时间，提高了回收率，且相对标准差较小；但是，该方法色谱柱用的是正相柱，基线不容易稳定。
3结论与讨论
经反复测定，方法二提取步骤简单、耗时短、回收率高、同一样品测定值稳定，比方法一更适用。这是因为方法二省去了皂化和浓缩过程，从而大大缩短了提取时间；而且由于麦角固醇极易分解，缩短了提取时间，这也会减小提取过程中麦角固醇的损失。提取过程中需要注意的是，由于麦角固醇容易分解，提取时避免让样品长时间暴露在空气中，尽量随时提取随时上机测定，并在测定样品的同时测定回收率。
[HS2*3][HT8.5H]参考文献：
[1]Mccaig A，Grayston S，Prosser J，et al. Impact of cultivation on characterisation of species composition of soil bacterial communities[J]. FEMS Microbiology Ecology，2001，35（1）：37-48.
[2]Borneman J，Skroch P，Osullivan K，et al. Molecular microbial diversity of an agricultural soil in Wisconsin[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，62（6）：1935-1943.
[3]王曙光，侯彦林. 磷脂脂肪酸方法在土壤微生物分析中的应用[J]. 微生物学通报，2004，31（1）：114-117.
[4]van Elsas J D，Duarte G F，Rosado A S，et al. Microbiological and molecular biological methods for monitoring microbial inoculants and their effects in the soil environment[J]. Mcrobiol Meth，1998，32：133-154.
[5]张汉波，段昌群，屈良鹄. 非培养方法在土壤微生物生态学研究中的应用[J]. 生态学杂志，2003，22（5）：131-136.
[6]Ruzicka S，Edgerton D，Norman M，et al. The utility of ergosterol as a bioindicator of fungi in temperate soils[J]. Soil Biology