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【摘要】为了鉴定分析球囊菌（Ascosphaera apis）几丁质酶基因分子特征，预测其编码蛋白的生物学功能，本实验对球囊菌几丁质酶基因Am-KZZ89578进行了PCR扩增，应用生物信息学方法对其编码氨基酸序列进行分析，预测编码蛋白的三级结构。结果显示， Am-KZZ89578基因全长958bp， 编码 421个氨基酸。多重序列比对和系统进化分析表明，Am-KZZ89578蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅲ亚家族成员，该蛋白的预测三级结构呈弯曲螺旋结构形式。本实验结构为球囊菌几丁质酶基因编码蛋白的生物学功能研究提供了基础参考。
【关键词】球囊菌 几丁质酶 基因 PCR
【中图分类号】G633.91 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2018）37-0131-03
几丁质（Chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖胺以β-1-4-糖苷键链接而成的线性多聚糖[1]，在自然界中几丁质是昆虫表皮的重要组成部分，参与昆虫表皮几丁质的降解，在昆虫的脱皮发育与生命活动中起着关键作用[2]。几丁质酶是能够降解几丁质的关键酶之一，昆虫的几丁质酶属于GH18家族的内切酶，主要存在于昆虫的体壁，脂肪体等组织，能够把几丁质水解成N-乙酰-D-氨基葡萄糖或寡聚物[1]。
蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是引起蜜蜂真菌传染病——白垩病（Chalkbrood disease）病原。昆虫病原真菌能通过分泌几丁质酶、蛋白酶等多种水解酶，来达到降解昆虫肠道围食膜和体壁几丁质保护层的作用。昆虫病原真菌超量表达几丁质酶和蛋白酶基因会提高菌株的毒力[3]。因此，对球囊菌几丁质酶基因进行鉴定和分析，将有助于了解几丁质酶在病原真菌入侵昆虫中的功能。
本研究对球囊菌几丁质酶基因Am-KZZ89578进行克隆鉴定，通过生物信息学方法预测该基因编码的氨基酸序列和3D的结构特征，分析其蛋白在几丁质酶家族成员中的分类和系统进化关系，以便为深入探讨球囊菌几丁质酶在入侵昆虫过程中的作用和以后防治措施提供基础资料。
1.材料与方法
1.1材料及主要试剂
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶等试剂购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒、PCR试剂盒、连接酶、抗生素等试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 DNA样本制备
培养和纯化球囊菌，加酒精，灭菌双蒸馏水清洗3次，吸干。将组织放入液氮研磨充分后转入离心管，56℃水浴1h，5-6min颠倒一次，用CTAB法提取DNA，700μL 2% CTAB，20μL 10% SDS，40μLβ-巯基乙醇，20μL 蛋白酶K。12000r/min离心，10min， 吸取上清，加等体积事先配好的苯酚、氯仿、异戊醇，比例为25：24：1，强烈混匀3min，然后12000r/min离心，5-10min。取上层溶液，加等体积氯仿，异戊醇，比例为24：1，12000r/min离心5min。取上层溶液，加2/3体积异丙醇，1/10提及的5mol/L PH5.2醋酸钠，轻混1min，-20℃沉淀1h，12000r/min离心5min。弃上清，加70%乙醇1mL漂洗，12000r/min离心3-10min，加60μL TE Buffer，0.6μL RNA酶，封口膜封号，37℃孵育摇床30min，电泳检测，-20℃保存备用。
1.3 目的基因PCR扩增
根据球囊菌中几丁质酶基因的参考序列，设计特异性引物，引物序列为：F：GGGGTACCATGATGTTCTCTAAGCTTTC； R：CCGCTCGAGCCGGGCTTGACAACTTTGCA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
以DNA为模板进行PCR扩增，TaqPCR 72μL；上，下游引物（mol/L）各6μL；DNA模板6μL，灭菌双蒸馏水60μL。PCR反应程序：94℃预变4min；94℃变40s；59.2℃退火40s；72℃延伸10 min，35个循环。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4目的基因克隆及序列分析
用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收目的基因片段，链接T载体，16℃恒温仪上连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，含LB琼脂平板筛选，选取阳性菌落37℃氨苄青霉素（100μg/mL）LB琼脂平板筛选，选取阳性菌落37℃培养12～16h，用質粒提取试剂盒提取重组质粒，经 PCR 鉴定正确后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.5 生物信息学分析
利用NovoPro将DNA序列翻译成氨基酸序列，然后利用Mega7.0和ClustalX与（Tc-NP_001034524.1； Tc-NP_0010
36067.1； Tc-NP_001036035.1； Ag-XP_315650.4； Ag-XP_0016
87765.2； Dm-NP_611542.2； Am-XP_006572082.1）6个代表物种的几丁质酶序列进行同源性比对与进化树分析。采用SWISSMODEL软件（https：//www.swissmodel.expasy.org）预测蛋白质三级结。
2.结果
2.1 PCR扩增结果
采用球囊菌几丁质酶基因Am-KZZ89578特异性引物对其DNA样本进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测，结果发现目的条带长约958bp，与预期片段大小一致，说明实验已成功扩增出球囊菌几丁质酶基因。
图1 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因PCR分析
2.2 目的基因测序结果
回收目的基因进行克隆与鉴定后，对养性重组质粒进行测序，结果见图，由图，球囊菌几丁质酶基因全长958 bp，编码421个氨基酸。 推导编码的氨基酸序列：
MMFSKLSVMPLLASLTAARFVAYIDQDHNSTLPSKSLT
GEIDHVILAFVQSSMLYNESTIVKWWDLPKIKSHFKENTTF
MVSIGGDPDFKQGFHKAVQSDESRKSYARKVANFVKREG
FDGVDIDWKYPGGITENETVEIRGFPSLLQEIRKAIGKNMT
LSIASPGVKKYMHAYTRQHAPNINAVDFLNILTEDQMDN FSNTTDYLSGISSCNDTISAYLELGMPPEKGNLGMPFYGQG
YSVEPDCKHGLGCKVVKPGEKKGKVVGQVSSFMWTAMY
MDANPPSKNASVAKDGEMCGPDTKKICPGKACCSPSGYC
GTTEDYCGWNCLPAWGHCNGSTSIGSFQKARKDKSAVT
DQGAFYLDKENNFFWTWDPAENYGDKYHTVIKDNKLGG
VMVWSLGEDSYDWSHLKKLSAVIKQHRM
2.3 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578氨基酸序列的多重比对分析
图2Am-KZZ89578蛋白的氨基酸序列特征和多序列对比分析
注：方框内阴影部分为保守的催化结构域：Ag-冈比亚按蚊，Dm-黑腹果蝇，Am-意大利蜜蜂，Tc-赤拟谷盗
将球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578氨基酸序列与冈比亚按蚊、黑腹果蝇、意大利蜜蜂、赤拟谷盗的几丁质酶序列进行比对分析，结果如图2所示。Am-KZZ89578的催化区含有几丁质酶的4个典型催化功能基序，分别为“KxxxxxGG”，“FDGxDLDWEFP”，“MxYDxxF”，“GAMxLxxNxD”[4]。这表明Am-KZZ89578蛋白与已报道的GH18家族Group-Ⅲ型几丁质酶的序列特征相似。
2.4 球囊菌几丁质酶基因系统进化树分析
采用ClustalX 和 Mega7.0软件对球囊菌几丁质酶KZZ89587与其他代表物种昆虫几丁质酶对应序列进行系统进化树分析，结果见图3，由图3可知，球囊菌几丁质酶基因与 GH18家族GroupⅢ的亲缘关系最近， 同处于一个遗传进化分支上。
图3 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因系统进化树
2.5球囊菌几丁质酶基因蛋白分子特征预测三级结构
利用SWISS-MODEL软件对球囊菌几丁质酶基因编码蛋白进行三级结构预测，结果见图4。
图4 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因编码蛋白
三级结构预测结果
由图4可知，球囊菌几丁质酶KZZ89578基因编码蛋白在三级结构中呈现出弯曲螺旋结构形式。KZZ89578的催化结构区含有 7个α-螺旋和 6个β-折叠。
3.讨论
球囊菌通过几丁质酶降解昆虫体壁的几丁质来达到穿透体壁的目的，不同亚家族几丁质酶在昆虫的生命活动中会参与不同的生理过程[2]。有研究报道，赤拟谷盗几丁质酶Group-Ⅲ成员并未参与到赤拟谷盗几丁质酶Group-Ⅲ的蜕皮，而是在化蛹时腹部收缩和翼/鞘翅中发挥重要作用[5]。本研究分析结果表明，球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578属于几丁质酶Group-Ⅲ亚家族成员，推测Am-KZZ89578蛋白可能在球囊菌在蜜蜂幼虫肠道中通过降解肠道围食膜几丁质壁，进而成功侵入蜜蜂肠道组织中发挥着作用。
4.结论
球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因全长958bp， 可编码421和氨基酸，其编码氨基酸序列中几丁质酶特有的活性基序高度保守，系统进化上为几丁质酶Group-Ⅲ家族成員，三级结构成弯曲螺旋结构形式。
参考文献：
[1]席羽.褐飞虱几丁质降解酶系基因家族分析[D].杭州：浙江大学，2014.
[2]李大琪.飞蝗几丁质酶家族基因功能及RNAi介导的害虫防治应用研究.山西大学，2016.
[3]刘朋虎.蜜蜂球囊菌几丁质酶纯化及酶学性质的研究.福建农林大学，2007.
[4]PAN Y，LU P， WANG Y，et al. In silico identification of novel chitinase？鄄like proteins in the silkworm， Bombyxmori， genome[J]. Journal of Insect Science， 2012（150）：1-14.
[5]Pesch YY， Riedel D， Patil K R， et al. Chitinases and imaginal disc growth factors organize the extracellular matrix formation at barrier tissues in insects[J]. Sci Rep， 2016.
【关键词】球囊菌 几丁质酶 基因 PCR
【中图分类号】G633.91 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2018）37-0131-03
几丁质（Chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖胺以β-1-4-糖苷键链接而成的线性多聚糖[1]，在自然界中几丁质是昆虫表皮的重要组成部分，参与昆虫表皮几丁质的降解，在昆虫的脱皮发育与生命活动中起着关键作用[2]。几丁质酶是能够降解几丁质的关键酶之一，昆虫的几丁质酶属于GH18家族的内切酶，主要存在于昆虫的体壁，脂肪体等组织，能够把几丁质水解成N-乙酰-D-氨基葡萄糖或寡聚物[1]。
蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是引起蜜蜂真菌传染病——白垩病（Chalkbrood disease）病原。昆虫病原真菌能通过分泌几丁质酶、蛋白酶等多种水解酶，来达到降解昆虫肠道围食膜和体壁几丁质保护层的作用。昆虫病原真菌超量表达几丁质酶和蛋白酶基因会提高菌株的毒力[3]。因此，对球囊菌几丁质酶基因进行鉴定和分析，将有助于了解几丁质酶在病原真菌入侵昆虫中的功能。
本研究对球囊菌几丁质酶基因Am-KZZ89578进行克隆鉴定，通过生物信息学方法预测该基因编码的氨基酸序列和3D的结构特征，分析其蛋白在几丁质酶家族成员中的分类和系统进化关系，以便为深入探讨球囊菌几丁质酶在入侵昆虫过程中的作用和以后防治措施提供基础资料。
1.材料与方法
1.1材料及主要试剂
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶等试剂购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒、PCR试剂盒、连接酶、抗生素等试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 DNA样本制备
培养和纯化球囊菌，加酒精，灭菌双蒸馏水清洗3次，吸干。将组织放入液氮研磨充分后转入离心管，56℃水浴1h，5-6min颠倒一次，用CTAB法提取DNA，700μL 2% CTAB，20μL 10% SDS，40μLβ-巯基乙醇，20μL 蛋白酶K。12000r/min离心，10min， 吸取上清，加等体积事先配好的苯酚、氯仿、异戊醇，比例为25：24：1，强烈混匀3min，然后12000r/min离心，5-10min。取上层溶液，加等体积氯仿，异戊醇，比例为24：1，12000r/min离心5min。取上层溶液，加2/3体积异丙醇，1/10提及的5mol/L PH5.2醋酸钠，轻混1min，-20℃沉淀1h，12000r/min离心5min。弃上清，加70%乙醇1mL漂洗，12000r/min离心3-10min，加60μL TE Buffer，0.6μL RNA酶，封口膜封号，37℃孵育摇床30min，电泳检测，-20℃保存备用。
1.3 目的基因PCR扩增
根据球囊菌中几丁质酶基因的参考序列，设计特异性引物，引物序列为：F：GGGGTACCATGATGTTCTCTAAGCTTTC； R：CCGCTCGAGCCGGGCTTGACAACTTTGCA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
以DNA为模板进行PCR扩增，TaqPCR 72μL；上，下游引物（mol/L）各6μL；DNA模板6μL，灭菌双蒸馏水60μL。PCR反应程序：94℃预变4min；94℃变40s；59.2℃退火40s；72℃延伸10 min，35个循环。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4目的基因克隆及序列分析
用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收目的基因片段，链接T载体，16℃恒温仪上连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，含LB琼脂平板筛选，选取阳性菌落37℃氨苄青霉素（100μg/mL）LB琼脂平板筛选，选取阳性菌落37℃培养12～16h，用質粒提取试剂盒提取重组质粒，经 PCR 鉴定正确后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.5 生物信息学分析
利用NovoPro将DNA序列翻译成氨基酸序列，然后利用Mega7.0和ClustalX与（Tc-NP_001034524.1； Tc-NP_0010
36067.1； Tc-NP_001036035.1； Ag-XP_315650.4； Ag-XP_0016
87765.2； Dm-NP_611542.2； Am-XP_006572082.1）6个代表物种的几丁质酶序列进行同源性比对与进化树分析。采用SWISSMODEL软件（https：//www.swissmodel.expasy.org）预测蛋白质三级结。
2.结果
2.1 PCR扩增结果
采用球囊菌几丁质酶基因Am-KZZ89578特异性引物对其DNA样本进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测，结果发现目的条带长约958bp，与预期片段大小一致，说明实验已成功扩增出球囊菌几丁质酶基因。
图1 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因PCR分析
2.2 目的基因测序结果
回收目的基因进行克隆与鉴定后，对养性重组质粒进行测序，结果见图，由图，球囊菌几丁质酶基因全长958 bp，编码421个氨基酸。 推导编码的氨基酸序列：
MMFSKLSVMPLLASLTAARFVAYIDQDHNSTLPSKSLT
GEIDHVILAFVQSSMLYNESTIVKWWDLPKIKSHFKENTTF
MVSIGGDPDFKQGFHKAVQSDESRKSYARKVANFVKREG
FDGVDIDWKYPGGITENETVEIRGFPSLLQEIRKAIGKNMT
LSIASPGVKKYMHAYTRQHAPNINAVDFLNILTEDQMDN FSNTTDYLSGISSCNDTISAYLELGMPPEKGNLGMPFYGQG
YSVEPDCKHGLGCKVVKPGEKKGKVVGQVSSFMWTAMY
MDANPPSKNASVAKDGEMCGPDTKKICPGKACCSPSGYC
GTTEDYCGWNCLPAWGHCNGSTSIGSFQKARKDKSAVT
DQGAFYLDKENNFFWTWDPAENYGDKYHTVIKDNKLGG
VMVWSLGEDSYDWSHLKKLSAVIKQHRM
2.3 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578氨基酸序列的多重比对分析
图2Am-KZZ89578蛋白的氨基酸序列特征和多序列对比分析
注：方框内阴影部分为保守的催化结构域：Ag-冈比亚按蚊，Dm-黑腹果蝇，Am-意大利蜜蜂，Tc-赤拟谷盗
将球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578氨基酸序列与冈比亚按蚊、黑腹果蝇、意大利蜜蜂、赤拟谷盗的几丁质酶序列进行比对分析，结果如图2所示。Am-KZZ89578的催化区含有几丁质酶的4个典型催化功能基序，分别为“KxxxxxGG”，“FDGxDLDWEFP”，“MxYDxxF”，“GAMxLxxNxD”[4]。这表明Am-KZZ89578蛋白与已报道的GH18家族Group-Ⅲ型几丁质酶的序列特征相似。
2.4 球囊菌几丁质酶基因系统进化树分析
采用ClustalX 和 Mega7.0软件对球囊菌几丁质酶KZZ89587与其他代表物种昆虫几丁质酶对应序列进行系统进化树分析，结果见图3，由图3可知，球囊菌几丁质酶基因与 GH18家族GroupⅢ的亲缘关系最近， 同处于一个遗传进化分支上。
图3 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因系统进化树
2.5球囊菌几丁质酶基因蛋白分子特征预测三级结构
利用SWISS-MODEL软件对球囊菌几丁质酶基因编码蛋白进行三级结构预测，结果见图4。
图4 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因编码蛋白
三级结构预测结果
由图4可知，球囊菌几丁质酶KZZ89578基因编码蛋白在三级结构中呈现出弯曲螺旋结构形式。KZZ89578的催化结构区含有 7个α-螺旋和 6个β-折叠。
3.讨论
球囊菌通过几丁质酶降解昆虫体壁的几丁质来达到穿透体壁的目的，不同亚家族几丁质酶在昆虫的生命活动中会参与不同的生理过程[2]。有研究报道，赤拟谷盗几丁质酶Group-Ⅲ成员并未参与到赤拟谷盗几丁质酶Group-Ⅲ的蜕皮，而是在化蛹时腹部收缩和翼/鞘翅中发挥重要作用[5]。本研究分析结果表明，球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578属于几丁质酶Group-Ⅲ亚家族成员，推测Am-KZZ89578蛋白可能在球囊菌在蜜蜂幼虫肠道中通过降解肠道围食膜几丁质壁，进而成功侵入蜜蜂肠道组织中发挥着作用。
4.结论
球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因全长958bp， 可编码421和氨基酸，其编码氨基酸序列中几丁质酶特有的活性基序高度保守，系统进化上为几丁质酶Group-Ⅲ家族成員，三级结构成弯曲螺旋结构形式。
参考文献：
[1]席羽.褐飞虱几丁质降解酶系基因家族分析[D].杭州：浙江大学，2014.
[2]李大琪.飞蝗几丁质酶家族基因功能及RNAi介导的害虫防治应用研究.山西大学，2016.
[3]刘朋虎.蜜蜂球囊菌几丁质酶纯化及酶学性质的研究.福建农林大学，2007.
[4]PAN Y，LU P， WANG Y，et al. In silico identification of novel chitinase？鄄like proteins in the silkworm， Bombyxmori， genome[J]. Journal of Insect Science， 2012（150）：1-14.
[5]Pesch YY， Riedel D， Patil K R， et al. Chitinases and imaginal disc growth factors organize the extracellular matrix formation at barrier tissues in insects[J]. Sci Rep， 2016.