【目的】以不同强度的启动子控制表达木酮糖激酶基因,并研究其引起的不同木酮糖激酶活性水平对木糖利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)代谢流向的影响。【方法】以酿酒酵母CEN.PK 113-5D为出发菌株,选择酿酒酵母内源启动子TEF1p,PGK1p和HXK2p,利用Cre-loxP无标记同源重组系统,置换染色体上木酮糖激酶基因XKS1的启动子(XKS1p)序列;并通过附加体质粒引入木糖代谢上游途径,构建不同水平表达木酮糖激酶的木糖利用工程菌株;从木酮糖激酶的转录水平、酶活水平、胞内的ATP浓度及木糖代谢等性状,对各菌株进行评价。【结果】转录及酶活测定结果显示,与天然状态相比,所选择的启动子对木酮糖激酶均表现出更强的启动效率。菌株体内表达木酮糖激酶活性水平由高至低的顺序为其基因XKS1在启动子PGK1p、TEF1p、HXK2p和XKS1p控制下。随着木酮糖激酶的活性的提高,胞内的ATP水平下降,而转化木糖生成乙醇的能力上升。最高乙醇产率为0.35 g/g消耗的总糖,此时副产物木糖醇产率最低,为0.18 g/g消耗的木糖。【结论】通过在染色体上置换启动子,提高了木酮糖激酶的表达水平。在一定范围内,木酮糖激酶的高活性有利于木糖向乙醇的转化。