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【摘 要】 目的 研究Zr4+对大鼠牙髓干细胞增殖及矿化功能的影响。 方法 四甲基偶氮噻唑盐（MTT）检测Zr4+对牙髓干细胞增殖的影响，碱性磷酸酶活性测定法检测其对牙髓干细胞成骨分化的影响。 结果 Zr4+在1×10-9-1×10-5mol/L 的浓度范围内均能够促进牙髓干细胞的增殖及分化。结论 锆离子对牙髓干细胞的增殖和分化具有促进作用，含锆物质适于应用于口腔护理。
【关键词】 锆离子 牙髓干细胞 增殖 成骨分化
【中图分类号】 R780.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）05-0042-02
在日常的生活中，由于先天遗传、后天的不良生活习惯以及物理性创伤等一系列因素都会导致牙体缺损。牙体缺损主要是指牙体硬组织在质地或生理解剖外形上不同程度的损坏或异常，常表现为牙体的形态、咬合或是邻接关系的破坏[1]。牙体受损时，将会导致食物咀嚼不充分，加重肠胃负担，连累消化系统。牙体受损后还会导致口腔黏膜受损，甚至引发关节紊乱症状。牙体受损，尤其是前牙的缺失对发音的影响尤为严重，将会影响到正常的社交沟通。此外，牙齿受损还会影响面部美观造成面部变形。由此可见，牙齿受损给人们的日常生活带来严重的负面影响[2]。随着科学技术的发展以及医疗条件的改善，现如今关于牙体缺损的修复方法多种多样，目前临床修复方法主要为义齿替换。现在可供患者选择的义齿种类繁多，主要包括镍铬合金、钴铬合金、贵金属、人工陶瓷、氧化锆等[3]。其中氧化锆全瓷牙由于其无可比拟的生物相容性、超高的机械强度、极低的导电率和导热率以及相对较低的价格备受患者们的青睐[4]。
干细胞是一种具有自我更新能力和高度分化潜能的细胞，在人体内包括胚胎干细胞和成体干细胞两类[5]。牙髓干细胞是位于牙髓组织中的一种成体干细胞，其具有自我更新和多项分化的潜能，是一种具有较强克隆能力的成体干细胞[6]。早在2000年，Gronthosd等人在体外成功的培养了牙髓干细胞，并证明了其在牙齿的形成中存在着极其重要的作用，有望将其应用在未来口腔护理及修复的领域[7]。
义齿在日常的使用过程中难免会出现磨损或者是溶出现象，氧化锆全瓷牙所游离出的Zr4+离子是否会对牙髓干细胞造成影响目前尚未有人报道。本文以大鼠牙髓干细胞为细胞模型，研究Zr4+是否影响大鼠牙髓干细胞的分化，从新的角度对氧化锆烤瓷牙进行评估。
1 材料和方法
1.1 实验材料
SD大鼠购自于河北医科大学动物实验中心；低糖DMEM培养基，胎牛血清购自于美国GBICO公司；青霉素，链霉素购自于石家庄制药集团；ZrCl4，噻唑蓝（MTT），β-甘油磷酸钠，抗坏血酸购自于美国Sigma公司；碱性磷酸酶测定试剂盒及考马斯亮蓝蛋白含量测定试剂盒购自于南京建成生物工程研究所，其他化学试剂均为国产分析纯，使用前未做任何纯化处理。
1.1 实验方法
1.1.1 大鼠牙髓干细胞的分离及培养
取5周龄SD大鼠，颈椎脱臼处死。在无菌条件下取出下颌骨，摘下下颌切牙并利用钳子夹碎硬质牙骨，取出牙髓，利用I型胶原蛋白酶对其进行消化，将游离下的细胞培养在完全生长培养基中（含有10% 胎牛血清，50 U/mL 青霉素，50 μg/mL 链霉素），置于含有含有5% CO2的湿式培养箱中进行培养，5 d后进行第一次换液处理，以后每隔3d换一次培养液。
1.1.2 细胞活力检测
将牙髓干细胞以2×104个/mL的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100 μL，接种后将细胞置于培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后，将Zr4+以不同浓度加入到各孔之中，使其终浓度分别为1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6和1×10-5 mol/L。并设立未加入Zr4+的细胞组为对照组，以及不加入细胞的孔作为空白组。将细胞培养24 h后向各孔中加入 10 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h，随后弃去培养基，每孔加入100μL DMSO，充分震荡后利用酶标仪在570 nm处读取吸光度值（OD），细胞活力计算如下：细胞活力=（OD实验组-OD空白）/（OD对照组-OD空白）×100%。
1.1.3 碱性磷酸酶活性检测
将牙髓干细胞以2×104个/mL的细胞密度接种于48孔细胞培养板中，每孔接种500 μL，待细胞完全铁壁后，向各孔中加入不同浓度的Zr4+，使其终浓度达到实验设计浓度。将细胞继续培养7 d，培养板中细胞利用PBS洗涤三遍，随后通过反复冻融将细胞进行裂解，并用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒和考马斯亮蓝试剂盒测定裂解液中的碱性磷酸酶活性和蛋白量，碱性磷酸酶活力用蛋白归一进行定量，结果表示如下：碱性磷酸酶活性=（ALP实验组/ALP对照组-1）×100%。
1.1.4 矿化结节诶染色
如上所述，将牙髓干细胞接种于48孔培养板中，待细胞完全贴壁后，将培养液弃去，并以条件诱导培养液所代替。（条件诱导培养液包含10-7 mol/L地塞米松，5.0 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L抗坏血酸）。以后每隔三天更换一次培养液，同时补充等量的Zr4+。待到结节生成后，利用茜素红对其进行染色：首先用PBS将细胞轻轻漂洗3遍，随后利用95%的乙醇将细胞进行固定10 min；将乙醇弃去后利用质量分数为0.1%的茜素红然也将细胞进行染色，30min后用清水洗去浮色，利用倒置相差显微镜进行观察。
1.1.5 统计分析
各项实验数据均来自至少3次独立的平行实验，数据结果以平均值±标准偏差表示。统计学差异利用t-test进行分析，p<0.05 认为存在显著性差异。
2实验结果
2.1 大鼠牙髓干细胞的分离及培养 如图1所示，将牙髓干细胞进行体外培养5d后可见细胞已完全贴壁，随着培养时间的延长，细胞伪足伸展均匀，整体呈多角形铺路石状。
2.2 Zr4+对牙髓干细胞细胞活力的影响
如图2所示，在浓度范围为1×10-9-1×10-5 mol/L的范围内Zr4+均能显示出促进牙髓及质干细胞增殖的能力，并呈现出一定的剂量依赖关系，当浓度为1×10-5 mol/L时促进作用最为明显，达到34.3%。
2.2 Zr4+对牙髓干细胞中碱性磷酸酶活性的影响
结果如图3显示，在细胞培养7d时，Zr4+的加入能够促进牙髓干细胞细胞内的碱性磷酸酶活性的表达，当Zr4+浓度为1×10-6 mol/L时，其促进作用高达71.7%。
2.3 Zr4+对牙髓干细胞矿化结节生长量的影响
如图4所示，在牙髓干细胞诱导分化的过程中，Zr4+的加入能够有效的促进牙髓干细胞矿化结节的生成。
3 讨论
干细胞是一种具有很强自我更新能力的细胞，根据干细胞的来源可将其分为胚胎干细胞和成体干细胞两种类型。通常意义来讲，在一条条件下，干细胞可以分化成为多种功能的细胞，因此其在未来医学研究和临床治疗中具有重大的价值。但是目前来说，利用胚胎干细胞面临着复杂的伦理学问题，关于它的应用在国际上还存在着很大的争议，因此对于成体干细胞的研究就具有着更加深远的意义。牙髓干细胞来源于牙齿，是一种具有超强更新能力及自我克隆能力的成体干细胞，同时它也具有多项分化潜能。Cronthos等人早在2000年就成功在体外分离并培养了该种细胞，而随后的研究也表明该种成体干细胞可被诱导分化为成牙本质样细胞，并能够形成牙质样结构，如果给予一定适宜的条件，可以通过离体培养技术完成新牙再生。此外，有学者报道，牙髓干细胞还具有向成骨分化的潜能，Andre等人利用牙髓干细胞成功修复了大鼠的颅骨缺损[8]。种种迹象都表明，牙髓干细胞的研究对于未来的疾病治疗意义非凡。
现如今由于种种原因造成牙体缺损的患者不占少数，其主要的治疗手段即为义齿替换。在众多不同材料的义齿中，氧化锆全瓷牙由于其良好的生物相容性、无致免疫效应、超高的机械理学特性以及极高的性价比备受人们的青睐。然而在日常使用过程中，由于咀嚼磨碎或是口腔内溶出可能会导致氧化锆中的锆离子溶出现象，这些游离的Zr是否会对骨髓干细胞的生长及分化造成影响？至今尚未有人报道。本文以牙髓干细胞为细胞模型，系统的研究了Zr对牙髓干细胞的影响，结果显示：在实验中所设计的各种浓度下均表示出促进牙髓干细胞增殖的效应，并且具有一定的浓度依赖性。当Zr4+浓度达到1×10-5mol/L时其对细胞存活率的促进可达到34.3%。碱性磷酸酶活性的表达是干细胞后期是否能够成功矿化的一个关键因素，因此它的表达量也是矿化形成评定的一个早期指标。实验发现，不同浓度的Zr4+均表现出一定的促进碱性磷酸酶表达的作用，其最强促进作用为71.7%。而随后的茜素红染色也表明，Zr4+能顾明显的促进牙髓干细胞的矿化形成。
综上所述，Zr4+离子不仅能够促进牙髓干细胞的增殖，其对牙髓干细胞的成骨分化也表现出明显的促进作用，但具体的机制仍有待进一步研究。
参考文献
[1] 巢永烈，梁星.我国牙体缺损保存修复的现状、存在问题与对策[J].中华口腔医学杂志，2006，41（6）：321-322.
[2] 李黛琼. 牙齿磨耗及其并发症的临床研究[J]. 求医问药（学术版），2012，10（11）：350-350.
[3] 赵树红.我院口腔修复分类与分析[J].滨州医学院学报，2012，1（35）：75-76.
[4] 吕卉. 氧化锆全瓷修复后1年的牙周状况分析[J].中国实用口腔科杂志，2010，3（6）：367-368.
[5] 张华.关于干细胞分类问题的辨析[J].2013，4：83-83.
[6] 王亦菁，张晓东，于华，金岩，史俊南.牙髓干细胞、外胚间充质干细胞裸鼠体内分化的实验研究[J].临床口腔医学杂志，2014，30（2）：78-80.
[7] Gronthos S， Mankani M， Brahim J et al. Postnatal human dental pulp stem cells （DPSCs） in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97（25）：13625-13630.
[8] Andre DE， Danicla F， Marilia T et al. Reconstruction of large area niall defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells [J]. J Cranio surg， 2008， 19（1）：204-210.
【关键词】 锆离子 牙髓干细胞 增殖 成骨分化
【中图分类号】 R780.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）05-0042-02
在日常的生活中，由于先天遗传、后天的不良生活习惯以及物理性创伤等一系列因素都会导致牙体缺损。牙体缺损主要是指牙体硬组织在质地或生理解剖外形上不同程度的损坏或异常，常表现为牙体的形态、咬合或是邻接关系的破坏[1]。牙体受损时，将会导致食物咀嚼不充分，加重肠胃负担，连累消化系统。牙体受损后还会导致口腔黏膜受损，甚至引发关节紊乱症状。牙体受损，尤其是前牙的缺失对发音的影响尤为严重，将会影响到正常的社交沟通。此外，牙齿受损还会影响面部美观造成面部变形。由此可见，牙齿受损给人们的日常生活带来严重的负面影响[2]。随着科学技术的发展以及医疗条件的改善，现如今关于牙体缺损的修复方法多种多样，目前临床修复方法主要为义齿替换。现在可供患者选择的义齿种类繁多，主要包括镍铬合金、钴铬合金、贵金属、人工陶瓷、氧化锆等[3]。其中氧化锆全瓷牙由于其无可比拟的生物相容性、超高的机械强度、极低的导电率和导热率以及相对较低的价格备受患者们的青睐[4]。
干细胞是一种具有自我更新能力和高度分化潜能的细胞，在人体内包括胚胎干细胞和成体干细胞两类[5]。牙髓干细胞是位于牙髓组织中的一种成体干细胞，其具有自我更新和多项分化的潜能，是一种具有较强克隆能力的成体干细胞[6]。早在2000年，Gronthosd等人在体外成功的培养了牙髓干细胞，并证明了其在牙齿的形成中存在着极其重要的作用，有望将其应用在未来口腔护理及修复的领域[7]。
义齿在日常的使用过程中难免会出现磨损或者是溶出现象，氧化锆全瓷牙所游离出的Zr4+离子是否会对牙髓干细胞造成影响目前尚未有人报道。本文以大鼠牙髓干细胞为细胞模型，研究Zr4+是否影响大鼠牙髓干细胞的分化，从新的角度对氧化锆烤瓷牙进行评估。
1 材料和方法
1.1 实验材料
SD大鼠购自于河北医科大学动物实验中心；低糖DMEM培养基，胎牛血清购自于美国GBICO公司；青霉素，链霉素购自于石家庄制药集团；ZrCl4，噻唑蓝（MTT），β-甘油磷酸钠，抗坏血酸购自于美国Sigma公司；碱性磷酸酶测定试剂盒及考马斯亮蓝蛋白含量测定试剂盒购自于南京建成生物工程研究所，其他化学试剂均为国产分析纯，使用前未做任何纯化处理。
1.1 实验方法
1.1.1 大鼠牙髓干细胞的分离及培养
取5周龄SD大鼠，颈椎脱臼处死。在无菌条件下取出下颌骨，摘下下颌切牙并利用钳子夹碎硬质牙骨，取出牙髓，利用I型胶原蛋白酶对其进行消化，将游离下的细胞培养在完全生长培养基中（含有10% 胎牛血清，50 U/mL 青霉素，50 μg/mL 链霉素），置于含有含有5% CO2的湿式培养箱中进行培养，5 d后进行第一次换液处理，以后每隔3d换一次培养液。
1.1.2 细胞活力检测
将牙髓干细胞以2×104个/mL的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100 μL，接种后将细胞置于培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后，将Zr4+以不同浓度加入到各孔之中，使其终浓度分别为1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6和1×10-5 mol/L。并设立未加入Zr4+的细胞组为对照组，以及不加入细胞的孔作为空白组。将细胞培养24 h后向各孔中加入 10 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h，随后弃去培养基，每孔加入100μL DMSO，充分震荡后利用酶标仪在570 nm处读取吸光度值（OD），细胞活力计算如下：细胞活力=（OD实验组-OD空白）/（OD对照组-OD空白）×100%。
1.1.3 碱性磷酸酶活性检测
将牙髓干细胞以2×104个/mL的细胞密度接种于48孔细胞培养板中，每孔接种500 μL，待细胞完全铁壁后，向各孔中加入不同浓度的Zr4+，使其终浓度达到实验设计浓度。将细胞继续培养7 d，培养板中细胞利用PBS洗涤三遍，随后通过反复冻融将细胞进行裂解，并用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒和考马斯亮蓝试剂盒测定裂解液中的碱性磷酸酶活性和蛋白量，碱性磷酸酶活力用蛋白归一进行定量，结果表示如下：碱性磷酸酶活性=（ALP实验组/ALP对照组-1）×100%。
1.1.4 矿化结节诶染色
如上所述，将牙髓干细胞接种于48孔培养板中，待细胞完全贴壁后，将培养液弃去，并以条件诱导培养液所代替。（条件诱导培养液包含10-7 mol/L地塞米松，5.0 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L抗坏血酸）。以后每隔三天更换一次培养液，同时补充等量的Zr4+。待到结节生成后，利用茜素红对其进行染色：首先用PBS将细胞轻轻漂洗3遍，随后利用95%的乙醇将细胞进行固定10 min；将乙醇弃去后利用质量分数为0.1%的茜素红然也将细胞进行染色，30min后用清水洗去浮色，利用倒置相差显微镜进行观察。
1.1.5 统计分析
各项实验数据均来自至少3次独立的平行实验，数据结果以平均值±标准偏差表示。统计学差异利用t-test进行分析，p<0.05 认为存在显著性差异。
2实验结果
2.1 大鼠牙髓干细胞的分离及培养 如图1所示，将牙髓干细胞进行体外培养5d后可见细胞已完全贴壁，随着培养时间的延长，细胞伪足伸展均匀，整体呈多角形铺路石状。
2.2 Zr4+对牙髓干细胞细胞活力的影响
如图2所示，在浓度范围为1×10-9-1×10-5 mol/L的范围内Zr4+均能显示出促进牙髓及质干细胞增殖的能力，并呈现出一定的剂量依赖关系，当浓度为1×10-5 mol/L时促进作用最为明显，达到34.3%。
2.2 Zr4+对牙髓干细胞中碱性磷酸酶活性的影响
结果如图3显示，在细胞培养7d时，Zr4+的加入能够促进牙髓干细胞细胞内的碱性磷酸酶活性的表达，当Zr4+浓度为1×10-6 mol/L时，其促进作用高达71.7%。
2.3 Zr4+对牙髓干细胞矿化结节生长量的影响
如图4所示，在牙髓干细胞诱导分化的过程中，Zr4+的加入能够有效的促进牙髓干细胞矿化结节的生成。
3 讨论
干细胞是一种具有很强自我更新能力的细胞，根据干细胞的来源可将其分为胚胎干细胞和成体干细胞两种类型。通常意义来讲，在一条条件下，干细胞可以分化成为多种功能的细胞，因此其在未来医学研究和临床治疗中具有重大的价值。但是目前来说，利用胚胎干细胞面临着复杂的伦理学问题，关于它的应用在国际上还存在着很大的争议，因此对于成体干细胞的研究就具有着更加深远的意义。牙髓干细胞来源于牙齿，是一种具有超强更新能力及自我克隆能力的成体干细胞，同时它也具有多项分化潜能。Cronthos等人早在2000年就成功在体外分离并培养了该种细胞，而随后的研究也表明该种成体干细胞可被诱导分化为成牙本质样细胞，并能够形成牙质样结构，如果给予一定适宜的条件，可以通过离体培养技术完成新牙再生。此外，有学者报道，牙髓干细胞还具有向成骨分化的潜能，Andre等人利用牙髓干细胞成功修复了大鼠的颅骨缺损[8]。种种迹象都表明，牙髓干细胞的研究对于未来的疾病治疗意义非凡。
现如今由于种种原因造成牙体缺损的患者不占少数，其主要的治疗手段即为义齿替换。在众多不同材料的义齿中，氧化锆全瓷牙由于其良好的生物相容性、无致免疫效应、超高的机械理学特性以及极高的性价比备受人们的青睐。然而在日常使用过程中，由于咀嚼磨碎或是口腔内溶出可能会导致氧化锆中的锆离子溶出现象，这些游离的Zr是否会对骨髓干细胞的生长及分化造成影响？至今尚未有人报道。本文以牙髓干细胞为细胞模型，系统的研究了Zr对牙髓干细胞的影响，结果显示：在实验中所设计的各种浓度下均表示出促进牙髓干细胞增殖的效应，并且具有一定的浓度依赖性。当Zr4+浓度达到1×10-5mol/L时其对细胞存活率的促进可达到34.3%。碱性磷酸酶活性的表达是干细胞后期是否能够成功矿化的一个关键因素，因此它的表达量也是矿化形成评定的一个早期指标。实验发现，不同浓度的Zr4+均表现出一定的促进碱性磷酸酶表达的作用，其最强促进作用为71.7%。而随后的茜素红染色也表明，Zr4+能顾明显的促进牙髓干细胞的矿化形成。
综上所述，Zr4+离子不仅能够促进牙髓干细胞的增殖，其对牙髓干细胞的成骨分化也表现出明显的促进作用，但具体的机制仍有待进一步研究。
参考文献
[1] 巢永烈，梁星.我国牙体缺损保存修复的现状、存在问题与对策[J].中华口腔医学杂志，2006，41（6）：321-322.
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[4] 吕卉. 氧化锆全瓷修复后1年的牙周状况分析[J].中国实用口腔科杂志，2010，3（6）：367-368.
[5] 张华.关于干细胞分类问题的辨析[J].2013，4：83-83.
[6] 王亦菁，张晓东，于华，金岩，史俊南.牙髓干细胞、外胚间充质干细胞裸鼠体内分化的实验研究[J].临床口腔医学杂志，2014，30（2）：78-80.
[7] Gronthos S， Mankani M， Brahim J et al. Postnatal human dental pulp stem cells （DPSCs） in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97（25）：13625-13630.
[8] Andre DE， Danicla F， Marilia T et al. Reconstruction of large area niall defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells [J]. J Cranio surg， 2008， 19（1）：204-210.