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目的对细粒棘球蚴原头节的β4微管蛋白(EgTub4)基因进行生物信息学预测和分析,并探索该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的最佳诱导条件,纯化目标蛋白。方法采用ProtParam、SMART、Predictprotein和Swiss-model软件分析EgTub4蛋白的理化性质和结构,采用SignalP4.1软件进行信号肽预测。提取细粒棘球蚴原头节的总RNA,并反转录成cDNA,PCR扩增EgTub4基因,构建原核重组表达载体pET28aEgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,进行酶切鉴定,并测序。探索重组蛋白rEgTub4可溶性表达的最佳诱导条件[表达载体、诱导温度(T)、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间(t)和培养基类型]。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Westernblotting)。结果经生物信息学分析预测EgTub4蛋白理论等电点(pI)值为4.79,理论相对分子质量(M_r)为49700;EgTub4不含信号肽,含有3个结构域,分别为微管蛋白GTPase结构域、C末端结构域和卷曲螺旋区。成功构建了重组质粒pET28a-EgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,经双酶切后,均可得到与目的基因相对分子质量相符的片段,测序正确。经Westernblotting分析,在表达质粒pET28a(+)、pET30a(+)和pET32a(+)中重组蛋白分别为M_r56000、60000、68000。EgTub4基因在pET28a(+)中表达时不可溶,主要以包涵体形式存在,需要在变性条件下进行纯化。而在pET30a(+)和pET32a(+)中表达时均部分可溶,可以在非变性条件下进行纯化。综合考虑,本研究最终选择pET30a(+)作为EgTub4基因的表达载体。目标蛋白可溶性表达的优化条件为:T=25℃、[IPTG]=0.01mmol/L、t=10h、2×YT培养液。最佳洗杂咪唑浓度为150mmol/L,洗脱咪唑浓度为500mmol/L。Western blotting分析结果显示,纯化的蛋白均能与β-微管蛋白抗体及His-Tag标签抗体反应,条带大小符合预期,约M_r 60000。结论对EgTub4进行了生物信息学预测、分析和表达,得到该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的最佳诱导条件,纯化目标蛋白。