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摘 要 为筛选胡椒不同组织间稳定表达的最佳内参基因，以胡椒栽培种‘热引1号’的主根、主蔓、花序和不同发育时期果实共8个组织为材料，采用实时荧光定量PCR技术，分析Polyubiquitin 1、Polyubiquitin 2、Polyubiquitin 3、GAPDH 1、GAPDH 2、Histone 3-1、Histone 3-2、Cyclophilin、Actin等共9个不同持家基因的表达差异情况。基于各个基因的Ct值，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper分析候选持家基因表达的稳定性。结果表明，在不同的组织中，9个持家基因的表达量存在差异。3个软件分析出的结果有所不同，综合分析结果显示，Histone 3-1表达最为稳定，其次为Polyubiquitin 1、GAPDH-2。内参基因标准化因子的配对差异分析（Vn/n+1）表明，Histone 3-1和Polyubiquitin 1是分析胡椒基因表达模式的最佳内参基因组合。
关键词 胡椒；实时荧光定量PCR；内参基因
中图分类号 Q949.732.3 文献标识码 A
The Identification of Internal Control Genes for Real-time
PCR Normalization in Black Pepper
HU Lisong， FAN Rui， WU Baoduo， WU Gang， TAN Lehe， HAO Chaoyun*
Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China
Abstract In order to identify the suitable internal control gene for the gene expression analysis in black pepper， the expression of 9 housekeeping genes， including Polyubiquitin 1， Polyubiquitin 2， Polyubiquitin 3， GAPDH 1， GAPDH 2， Histone 3-1， Histone 3-2， Cyclophilin and Actin were assessed by using real time quantitative PCR in 8 different tissues. On the basis of Ct value comparison， the stability of housekeeping gene expression was analyzed by using geNorm， NormFinder and BestKeeper. The results of comprehensive ranking by three methods indicated that the most stable three reference genes were Histone 3-1， Polyubiquitin 1 and GAPDH 2. The value of pairwise variation Vn/n+1 suggested that Histone 3-1 and Polyubiquitin 1 had to be used together for normalization， which would make the expression of target genes more reliable in black pepper.
Key words Black pepper； real-time PCR； internal control gene
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.10.021
实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）是一种新的核酸定量技术，通过在PCR反应体系中添加特定荧光基团，对整个PCR 反应过程中的产物变化进行实时监测[1-2]。与传统的RT-PCR相比，该技术具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点，已被广泛应用于基因的表达模式分析。但该技术同样受RNA质量、反转录及PCR扩增效率等因素影响，在分析目的基因表达量时，往往需要引入内参基因进行校正，内参基因的筛选是应用qPCR进行基因表达分析的重要前提[3-4]。
理想的内参基因应稳定表达于不同的组织和细胞中，且表達量不受内源性或外源性因素的影响。一些维持正常生命代谢所必需的持家基因，比如18S rRNA、组蛋白（Histone）基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）、肌动蛋白基因（Actin）等常被用作内参[5]。越来越多研究表明，不同的植物、不同的试验处理组织中，这类基因的表达量并不恒定。因此，在qPCR分析中有必要对候选内参基因的表达稳定性进行评价，并选出适合的内参基因[6]。相关研究者基于qPCR分析中基因表达的Ct值，开发了一系列专门用于分析内参基因稳定性的程序，目前应用最多的主要有geNorm、NormFinder和BestKeeper[7-9]。这3款软件的工作原理各不相同，因此常常将三者配合起来用于评估候选基因的稳定性，以期筛选出相对适宜的内参基因。
胡椒（Piper nigrum L.）为胡椒科（Piperaceae）胡椒属（Piper）多年生常绿藤本植物，是世界上最重要的香辛料作物之一，素有“香料之王”的美誉，用途广泛，经济价值高[10]。中国胡椒主要种植在海南、云南、广东等地，年产量达3.6万吨，居世界第五位，目前已发展成为年产值超20亿且关系到100万以上农村人口就业的重要热作产业[11]。随着胡椒分子生物学研究的不断深入，基因表达分析已经被广泛应用于胡椒功能基因组学研究中，但国内外有关内参基因的筛选尚未见报道。本研究基于课题组转录组测序胡椒序列，利用qPCR技术，采用geNorm、NormFinder和BestKeeper，分析了Polyubiquitin、GAPDH、Histone等9个持家基因在8个不同胡椒组织间的表达稳定性，筛选在胡椒不同组织中稳定表达的内参基因，研究结果为胡椒基因表达模式分析提供重要参考。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 本研究以盛产期的胡椒栽培种‘热引1号’为实验材料，椒龄10年，种植于中国热带农业科学院香料饮料研究所胡椒种质资源圃，土壤、水肥等栽培条件相对一致。收集主根、主蔓、叶、雄花序（雌蕊未露出）、嫩果（开花后2个月左右，2 MAP）、膨大期果实（开花后5个月，5 MAP）、干物质积累期果实（开花后7个月，7 MAP）、成熟期果实（开花后9个月，9 MAP），每个组织从不同的植株上取樣3次（生物学重复），于-80 ℃保存。
1.1.2 试剂 RNA提取采用Sigma试剂盒（STRN10）；反转录酶采用Thermo Scientific Fermentas试剂盒（K1621）；荧光定量试剂盒为TAKARA 公司SYBR PremixExTaq TM II试剂（RR820A）；其他试剂购自国药基团化学试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 总RNA抽提和cDNA合成 将所有样品在液氮下充分研磨成粉末，总RNA提取按照Sigma试剂盒说明书要求进行，提取完毕后经DNA酶处理以去除基因组DNA，用Nanodrop 2000C核酸分析仪测定RNA 的浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性及纯度。统一取3 μg总RNA，按照Thermo Scientific Fermentas试剂盒说明书合成不同组织的cDNA模版，于-20 ℃保存备用。
1.2.2 引物设计和扩增特异性检测 持家基因序列均来自课题组转录组测序序列[12-13]。采用Primer 5.0设计引物，引物扩增特异性采用荧光实时PCR溶解曲线分析。以8个组织cDNA等量混合样为模版，扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环；扩增完毕后，进行熔解曲线分析以确定扩增产物的特异性，温度从60 ℃缓慢递增到95 ℃，连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线，根据溶解曲线中的荧光变化来确定扩增产物的特异性。
1.2.3 持家基因的qPCR扩增及表达稳定性分析
选取扩增产物特异的引物进行后续分析，qPCR分析按照SYBR PremixExTaq TM II试剂说明书进行。扩增程序为经典的2步法：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，于退火阶段收集数据，共40个循环，根据Ct值计算基因表达丰度。基于3次重复的Ct值平均值，采用geNorm、NormFinder和 BestKeeper分析候选基因的表达稳定性。根据内参基因标准化因子的配对差异分析（Vn/n+1）确定需要的内参基因数。
2 结果与分析
2.1 持家基因引物扩增特异性分析
根据胡椒转录组测序序列，合成候选基因扩增引物，所有引物退火温度为58 ℃，PCR产物长度为100 bp到200 bp之间，引物信息见表1。以8个不同组织的cDNA混合液为模版，分析候选基因的扩增及溶解曲线。结果显示，各候选基因的扩增曲线重复性高，溶解曲线有且仅有一个特异的信号峰，说明所用引物扩增产物特异，不存在引物二聚体及其他非特异扩增带，可用于后续稳定性分析（图1）。
2.2 候选持家基因qPCR分析
分别以不同组织的cDNA为模板，进行qPCR 分析，持家基因的Ct值如图2所示。基因表达丰度越高，Ct值越小，反之Ct值越大。9个候选内参基因的Ct值比较结果表明，所有组织中每个候选基因的表达水平都有一定的变化，不同基因的表达丰度各异，但整体趋势变化不大。
2.3 持家基因表达稳定性分析
2.3.1 持家基因表达稳定性geNorm分析
geNorm基于基因表达稳定值M，对候选内参基因的表达稳定度进行排序，M值越小表明所选的内参基因越稳定。图3表明，候选基因表达稳定性由高到低的顺序为：Histone 3-1=GAPDH 2（M=0.28）>Polyubiquitin 1（M=0.41）>Histone 3-2（M=0.48）>Cyclophilin（M=0.51）>Actin（M=0.56）>Polyubiquitin 3（M=0.74）>Polyubiquitin 2（M=0.96）>GAPDH 1（M=1.36）。以M<0.5为阈值，Histone 3-1、GAPDH 2、Polyubiquitin 1、Histone 3-2均可作为内参基因。内参基因的配对差异值（Vn/n+1）分析发现，除V8/9的值大于0.15外，其他均小于0.15，说明在对不同组织进行基因表达分析时无需加入第3个内参基因进行数据校正（图4），选择2个稳定性最高的基因即可作为内参进行基因表达模式分析。
2.3.2 持家基因表达稳定性NormFinder分析
NormFinder基于方差分析，对内参基因的表达稳定性进行直接评价，根据基因表达稳定值筛选合适的内参，稳定值越低，表示基因表达越稳定。从表2数据可以看出，Histone 3-1和Polyubiquitin 1的稳定性最好，GAPDH 2稳定性次之。该结果与geNorm分析结果有所不同，但整体趋势相对一致，Polyubiquitin 1、Histone 3-1和GAPDH 2表达相对稳定，而GAPDH 1的稳定性最低。
2.3.3 候选基因表达稳定性BestKeeper分析
BestKeeper分析主要以基因表达Ct值的标准变异系数（SD）和变异相关系数（CV）来判断内参基因的稳定性，SD（stddev）越小，CV值越小，表明该基因越稳定。BestKeeper分析结果如表3所示，Actin、Histone 3-1和Polyubiquitin 1的稳定性最好，GAPDH 1稳定性最低。 3 讨论
内参基因的筛选是基因表达模式分析的前提，不同物种、不同类型组织间适用的内参基因各不相同。因持家基因产物对维持细胞基本生命活动的重要性及其组成型稳定表达的特征，持家基因成為天然的内参基因最佳候选。Gutierrez等[14]系统分析了拟南芥10个持家基因在14个不同组织器官中的表达稳定性，结果表明Adenine phosphoribosyltransferase 1和Ubiquitin 5稳定性最好。Jain等[15]分析了水稻中10个常用内参基因在25个水稻样品中的表达稳定性，结果表明Ubiquitin 5和Eukaryotic elongation factor 1-alpha表达稳定性最好。涂礼莉等[16]研究发现，在棉花中内参基因于纤维发育后期表达量都呈现下调趋势，纤维发育过程中基因表达分析需将多个内参基因组合使用。而在大多缺少参考序列的非模式作物中，研究者根据已有作物持家基因的保守区域进行引物合成。以热带作物菠萝蜜为例，汪永保等[17]通过同源基因的保守区域设计了5个持家基因引物序列进行稳定性分析，尽管根据基因表达的Ct值，研究者可以鉴定出表达相对稳定的内参基因，但配对差异分析则无法获得小于0.15的Vn/n+1的组合。随着菠萝蜜基因序列的公开，基于菠萝蜜自身序列的筛选，则可以获得满足研究需要的内参基因[18]。因此，随着基因信息的不断丰富，针对不同物种、不同的实验条件和样品类型，内参基因稳定性的重新评估仍然非常必要。
近年来，针对内参基因筛选的程序陆续推出，目前应用最广泛的软件主要有geNorm、NormFinder和BestKeeper[7-9]。本研究采用3款软件分析了9个胡椒持家基因在8个不同组织中的表达稳定性，结果显示在所有基因中，Histone 3-1、GAPDH 2、Polyubiquitin 1、Actin的表达相对稳定，由于计算的原理不同，3款软件给出的顺序不完全一致。geNorm的稳定性排序为Histone 3-1=GAPDH 2>Polyubiquitin 1，以M<0.5为阈值，这3个基因均可作为内参。NormFinder给出的顺序为Histone 3-1=Polyubiquitin 1>GAPDH 2。Bestkeeper给出顺序为Actin>Histone 3-1>Polyubiquitin 1。综合分析后认为，Histone 3-1、GAPDH 2和Polyubiquitin 1的表达相对稳定，可作为qPCR分析的内参基因。
研究表明，使用单一基因作为内参进行表达模式校准和标准化会对实验结果产生影响。geNorm引入了内参基因的配对差异值（Vn/n+1）分析，用来评价最佳的内参基因数，软件推荐的阈值为0.15，对于内参基因的数量，geNorm的开发人Vandesompele认为一般情况下可直接选择最稳定的3个基因作为内参。本研究中除V8/9的值大于0.15外，其他均小于0.15，因此认为选择2个稳定性最高的基因可满足分析的需求。综上所述，建议以Histone 3-1和Polyubiquitin 1 2个表达相对稳定的基因作为参照，是分析胡椒基因表达模式的最佳内参基因组合。本研究结果为利用qPCR技术分析胡椒基因表达模式提供了重要的参考。
参考文献
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[16] 涂礼莉， 张献龙， 刘迪秋， 等. 棉花纤维发育和体细胞胚发生过程中实时定量PCR内对照基因的筛选[J]. 科学通报， 2007， 52（20）： 2 379-2 385.
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关键词 胡椒；实时荧光定量PCR；内参基因
中图分类号 Q949.732.3 文献标识码 A
The Identification of Internal Control Genes for Real-time
PCR Normalization in Black Pepper
HU Lisong， FAN Rui， WU Baoduo， WU Gang， TAN Lehe， HAO Chaoyun*
Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China
Abstract In order to identify the suitable internal control gene for the gene expression analysis in black pepper， the expression of 9 housekeeping genes， including Polyubiquitin 1， Polyubiquitin 2， Polyubiquitin 3， GAPDH 1， GAPDH 2， Histone 3-1， Histone 3-2， Cyclophilin and Actin were assessed by using real time quantitative PCR in 8 different tissues. On the basis of Ct value comparison， the stability of housekeeping gene expression was analyzed by using geNorm， NormFinder and BestKeeper. The results of comprehensive ranking by three methods indicated that the most stable three reference genes were Histone 3-1， Polyubiquitin 1 and GAPDH 2. The value of pairwise variation Vn/n+1 suggested that Histone 3-1 and Polyubiquitin 1 had to be used together for normalization， which would make the expression of target genes more reliable in black pepper.
Key words Black pepper； real-time PCR； internal control gene
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.10.021
实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）是一种新的核酸定量技术，通过在PCR反应体系中添加特定荧光基团，对整个PCR 反应过程中的产物变化进行实时监测[1-2]。与传统的RT-PCR相比，该技术具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点，已被广泛应用于基因的表达模式分析。但该技术同样受RNA质量、反转录及PCR扩增效率等因素影响，在分析目的基因表达量时，往往需要引入内参基因进行校正，内参基因的筛选是应用qPCR进行基因表达分析的重要前提[3-4]。
理想的内参基因应稳定表达于不同的组织和细胞中，且表達量不受内源性或外源性因素的影响。一些维持正常生命代谢所必需的持家基因，比如18S rRNA、组蛋白（Histone）基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）、肌动蛋白基因（Actin）等常被用作内参[5]。越来越多研究表明，不同的植物、不同的试验处理组织中，这类基因的表达量并不恒定。因此，在qPCR分析中有必要对候选内参基因的表达稳定性进行评价，并选出适合的内参基因[6]。相关研究者基于qPCR分析中基因表达的Ct值，开发了一系列专门用于分析内参基因稳定性的程序，目前应用最多的主要有geNorm、NormFinder和BestKeeper[7-9]。这3款软件的工作原理各不相同，因此常常将三者配合起来用于评估候选基因的稳定性，以期筛选出相对适宜的内参基因。
胡椒（Piper nigrum L.）为胡椒科（Piperaceae）胡椒属（Piper）多年生常绿藤本植物，是世界上最重要的香辛料作物之一，素有“香料之王”的美誉，用途广泛，经济价值高[10]。中国胡椒主要种植在海南、云南、广东等地，年产量达3.6万吨，居世界第五位，目前已发展成为年产值超20亿且关系到100万以上农村人口就业的重要热作产业[11]。随着胡椒分子生物学研究的不断深入，基因表达分析已经被广泛应用于胡椒功能基因组学研究中，但国内外有关内参基因的筛选尚未见报道。本研究基于课题组转录组测序胡椒序列，利用qPCR技术，采用geNorm、NormFinder和BestKeeper，分析了Polyubiquitin、GAPDH、Histone等9个持家基因在8个不同胡椒组织间的表达稳定性，筛选在胡椒不同组织中稳定表达的内参基因，研究结果为胡椒基因表达模式分析提供重要参考。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 本研究以盛产期的胡椒栽培种‘热引1号’为实验材料，椒龄10年，种植于中国热带农业科学院香料饮料研究所胡椒种质资源圃，土壤、水肥等栽培条件相对一致。收集主根、主蔓、叶、雄花序（雌蕊未露出）、嫩果（开花后2个月左右，2 MAP）、膨大期果实（开花后5个月，5 MAP）、干物质积累期果实（开花后7个月，7 MAP）、成熟期果实（开花后9个月，9 MAP），每个组织从不同的植株上取樣3次（生物学重复），于-80 ℃保存。
1.1.2 试剂 RNA提取采用Sigma试剂盒（STRN10）；反转录酶采用Thermo Scientific Fermentas试剂盒（K1621）；荧光定量试剂盒为TAKARA 公司SYBR PremixExTaq TM II试剂（RR820A）；其他试剂购自国药基团化学试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 总RNA抽提和cDNA合成 将所有样品在液氮下充分研磨成粉末，总RNA提取按照Sigma试剂盒说明书要求进行，提取完毕后经DNA酶处理以去除基因组DNA，用Nanodrop 2000C核酸分析仪测定RNA 的浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性及纯度。统一取3 μg总RNA，按照Thermo Scientific Fermentas试剂盒说明书合成不同组织的cDNA模版，于-20 ℃保存备用。
1.2.2 引物设计和扩增特异性检测 持家基因序列均来自课题组转录组测序序列[12-13]。采用Primer 5.0设计引物，引物扩增特异性采用荧光实时PCR溶解曲线分析。以8个组织cDNA等量混合样为模版，扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环；扩增完毕后，进行熔解曲线分析以确定扩增产物的特异性，温度从60 ℃缓慢递增到95 ℃，连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线，根据溶解曲线中的荧光变化来确定扩增产物的特异性。
1.2.3 持家基因的qPCR扩增及表达稳定性分析
选取扩增产物特异的引物进行后续分析，qPCR分析按照SYBR PremixExTaq TM II试剂说明书进行。扩增程序为经典的2步法：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，于退火阶段收集数据，共40个循环，根据Ct值计算基因表达丰度。基于3次重复的Ct值平均值，采用geNorm、NormFinder和 BestKeeper分析候选基因的表达稳定性。根据内参基因标准化因子的配对差异分析（Vn/n+1）确定需要的内参基因数。
2 结果与分析
2.1 持家基因引物扩增特异性分析
根据胡椒转录组测序序列，合成候选基因扩增引物，所有引物退火温度为58 ℃，PCR产物长度为100 bp到200 bp之间，引物信息见表1。以8个不同组织的cDNA混合液为模版，分析候选基因的扩增及溶解曲线。结果显示，各候选基因的扩增曲线重复性高，溶解曲线有且仅有一个特异的信号峰，说明所用引物扩增产物特异，不存在引物二聚体及其他非特异扩增带，可用于后续稳定性分析（图1）。
2.2 候选持家基因qPCR分析
分别以不同组织的cDNA为模板，进行qPCR 分析，持家基因的Ct值如图2所示。基因表达丰度越高，Ct值越小，反之Ct值越大。9个候选内参基因的Ct值比较结果表明，所有组织中每个候选基因的表达水平都有一定的变化，不同基因的表达丰度各异，但整体趋势变化不大。
2.3 持家基因表达稳定性分析
2.3.1 持家基因表达稳定性geNorm分析
geNorm基于基因表达稳定值M，对候选内参基因的表达稳定度进行排序，M值越小表明所选的内参基因越稳定。图3表明，候选基因表达稳定性由高到低的顺序为：Histone 3-1=GAPDH 2（M=0.28）>Polyubiquitin 1（M=0.41）>Histone 3-2（M=0.48）>Cyclophilin（M=0.51）>Actin（M=0.56）>Polyubiquitin 3（M=0.74）>Polyubiquitin 2（M=0.96）>GAPDH 1（M=1.36）。以M<0.5为阈值，Histone 3-1、GAPDH 2、Polyubiquitin 1、Histone 3-2均可作为内参基因。内参基因的配对差异值（Vn/n+1）分析发现，除V8/9的值大于0.15外，其他均小于0.15，说明在对不同组织进行基因表达分析时无需加入第3个内参基因进行数据校正（图4），选择2个稳定性最高的基因即可作为内参进行基因表达模式分析。
2.3.2 持家基因表达稳定性NormFinder分析
NormFinder基于方差分析，对内参基因的表达稳定性进行直接评价，根据基因表达稳定值筛选合适的内参，稳定值越低，表示基因表达越稳定。从表2数据可以看出，Histone 3-1和Polyubiquitin 1的稳定性最好，GAPDH 2稳定性次之。该结果与geNorm分析结果有所不同，但整体趋势相对一致，Polyubiquitin 1、Histone 3-1和GAPDH 2表达相对稳定，而GAPDH 1的稳定性最低。
2.3.3 候选基因表达稳定性BestKeeper分析
BestKeeper分析主要以基因表达Ct值的标准变异系数（SD）和变异相关系数（CV）来判断内参基因的稳定性，SD（stddev）越小，CV值越小，表明该基因越稳定。BestKeeper分析结果如表3所示，Actin、Histone 3-1和Polyubiquitin 1的稳定性最好，GAPDH 1稳定性最低。 3 讨论
内参基因的筛选是基因表达模式分析的前提，不同物种、不同类型组织间适用的内参基因各不相同。因持家基因产物对维持细胞基本生命活动的重要性及其组成型稳定表达的特征，持家基因成為天然的内参基因最佳候选。Gutierrez等[14]系统分析了拟南芥10个持家基因在14个不同组织器官中的表达稳定性，结果表明Adenine phosphoribosyltransferase 1和Ubiquitin 5稳定性最好。Jain等[15]分析了水稻中10个常用内参基因在25个水稻样品中的表达稳定性，结果表明Ubiquitin 5和Eukaryotic elongation factor 1-alpha表达稳定性最好。涂礼莉等[16]研究发现，在棉花中内参基因于纤维发育后期表达量都呈现下调趋势，纤维发育过程中基因表达分析需将多个内参基因组合使用。而在大多缺少参考序列的非模式作物中，研究者根据已有作物持家基因的保守区域进行引物合成。以热带作物菠萝蜜为例，汪永保等[17]通过同源基因的保守区域设计了5个持家基因引物序列进行稳定性分析，尽管根据基因表达的Ct值，研究者可以鉴定出表达相对稳定的内参基因，但配对差异分析则无法获得小于0.15的Vn/n+1的组合。随着菠萝蜜基因序列的公开，基于菠萝蜜自身序列的筛选，则可以获得满足研究需要的内参基因[18]。因此，随着基因信息的不断丰富，针对不同物种、不同的实验条件和样品类型，内参基因稳定性的重新评估仍然非常必要。
近年来，针对内参基因筛选的程序陆续推出，目前应用最广泛的软件主要有geNorm、NormFinder和BestKeeper[7-9]。本研究采用3款软件分析了9个胡椒持家基因在8个不同组织中的表达稳定性，结果显示在所有基因中，Histone 3-1、GAPDH 2、Polyubiquitin 1、Actin的表达相对稳定，由于计算的原理不同，3款软件给出的顺序不完全一致。geNorm的稳定性排序为Histone 3-1=GAPDH 2>Polyubiquitin 1，以M<0.5为阈值，这3个基因均可作为内参。NormFinder给出的顺序为Histone 3-1=Polyubiquitin 1>GAPDH 2。Bestkeeper给出顺序为Actin>Histone 3-1>Polyubiquitin 1。综合分析后认为，Histone 3-1、GAPDH 2和Polyubiquitin 1的表达相对稳定，可作为qPCR分析的内参基因。
研究表明，使用单一基因作为内参进行表达模式校准和标准化会对实验结果产生影响。geNorm引入了内参基因的配对差异值（Vn/n+1）分析，用来评价最佳的内参基因数，软件推荐的阈值为0.15，对于内参基因的数量，geNorm的开发人Vandesompele认为一般情况下可直接选择最稳定的3个基因作为内参。本研究中除V8/9的值大于0.15外，其他均小于0.15，因此认为选择2个稳定性最高的基因可满足分析的需求。综上所述，建议以Histone 3-1和Polyubiquitin 1 2个表达相对稳定的基因作为参照，是分析胡椒基因表达模式的最佳内参基因组合。本研究结果为利用qPCR技术分析胡椒基因表达模式提供了重要的参考。
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