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摘 要：目的主要是在结合实际的基础上促使天麻丸的微生物限度检查方法得以顺利建立。方法将中国药典2015年版四部非无菌产品微生物限度检查方法作为主要依据，促使方法适用性试验得以顺利开展。结果其中两个企业在实际检查过程中使用的方法为常规检查，其余两个企业主要是借助稀释法进行检查工作。结论在消除产品抑菌成分对微生物检验的影响方面稀释法起着不可替代的重要作用。
关键词：微生物限度检查;天麻丸;中国药典
天麻丸在中成药品种涵盖范围之内，其中包含10味中药材，主要涉及到天麻、羌活、独活、地黄等，在此基础上进行加工可实现对成水蜜丸，小蜜丸和大蜜丸的有效炼制，现阶段市场内一般销售的品种为水蜜丸以及大蜜丸。加入适当的生药原粉是中成药丸剂的主要生产工艺，这也是药品安全高度重视，微生物的负载和污染菌的状况的主要原因。最新版中国药典与传统药典相比有相当大的变化，在实际试验过程注意对其进行科学借鉴。
一、仪器、材料与样品
1.仪器
Thermo1378生物安全柜;InterScienceS500自动菌落计数器;ThermoIGS180培养箱;SanyoMIR254生化培养箱;TomySX-700高压灭菌器。
2.培养基
大豆酪蛋白胨琼脂培养基，大豆酪蛋白胨液体培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基，肠道菌增菌液体培养基，麦康凯肉汤培养基等都可在这一试验中进行使用，注意结合实际与试验要求也可科学选择，麦康凯琼脂培养基，紫红胆盐葡萄糖琼脂，RV沙门菌增菌肉汤培养基，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂，三糖铁琼脂等培养基。
需要注意的是上述培养基的提供单位都为广东环凯微生物科技有限公司生产。北京三药科技开发公司所提供的培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基。在实际使用之前我们必须针对培养基进行严格的适用性检查，检查结果符合相关标准与要求的才可以真正投入使用。
3.菌种
金黄色葡萄球菌（S.aureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）[CMCC（B）63501]大肠埃希菌（E.coli）[CMCC（B）44102]白色念珠菌（C.albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（A.niger）[CMCC（F）98003]、乙型副伤寒沙门菌（S.paratyphiB）[CMCC（B）50094]均来自中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心，试验菌为第3代菌株。
二、方法与结果
1.菌液制备
大豆酪蛋白胨液体培养基主要接种对象为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，注意将温度控制在30-35℃范围之间，培养时间为18-24h。沙氏葡萄糖液体培养基接种对象为白色念珠菌接种，需要在20-25℃的范围之内培养2-3d。
黑曲霉主要是在沙氏葡萄糖琼脂培养基中进行接种，其温度也需要控制在20-25℃之间，但其培养时间较长，需要5-7d。在实际针对孢子进行洗脱工作的过程当中我们需要借助0.05%的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。最后将上述菌株制成菌液备用，注意起级别为稀释级，这一过程中所使用的溶液为0.9%无菌氯化钠溶液。
2.实验方法
（1）微生物计数方法适用性试验-平皿法
取供试品10g，加大豆酪蛋白胨液体培养基至100mL，匀浆，静置约5min，取上层液体即为1∶10供试液，取1mL注皿，分别倾注大豆酪蛋白胨琼脂培养基及沙氏葡萄糖琼脂培养基，作为供试品对照组。
另取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加至9.9mL上述供试液，混匀，使每毫升混合液含菌量不大于100cfu，取上述混合液1mL注入平皿，倾注大豆酪蛋白胨琼脂培养基，每个菌株分别制备2个平板，取白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加至9.9mL上述供试液，混匀，使每毫升混合液含菌量不大于100。
（2）微生物计数方法适用性试验———稀释法
制作供试品对照组及菌液组，培养，计数，计算回收比值。2.2.3控制菌检查方法适用性试验耐胆盐革兰阴性菌检查：按照“2.2.1”方法制备1∶10供试液，置20～25℃培养约2h，取相当于供试品0.1、0.01、0.001g的预培养物分别加至10mL的肠道菌增菌液体培养基中，一式2份，其中1份3管每管中加入不大于100cfu的大肠埃希菌，另1份3管每管中加入不大于100cfu的铜绿假单胞菌，按照药典规定方法培养后，每管分别划线接种到紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，培养后观察结果。
三、讨论
考察了4个厂家5个品种的天麻丸的微生物限度检查方法，虽然都是按照中国药典2015年版的处方进行生产，但其产品对微生物的检出有不同程度的干扰现象，部分产品应采用稀释法进行检查，才能顺利检出样品中可能污染的微生物，究其原因，可能与原药材产地、炮制方法、不同辅料对微生物生长环境的影响、还有生产工艺有一定的关系。
说明同一品种不同企业生产的产品不能死搬硬套同一种微生物限度检查法，而应该经过方法适用性确定其可行性;企业生产的同一个品种，在原药材产地、批次、炮制方法以及生产工艺发生改变的时候，也应该进行方法确认其检查方法的可行性;药检所对抽验药品进行检验时，遇到不同企业的产品，在条件许可的情况下，也应尽可能获取相应的检验方法资料。
关于稀释法的操作，本试验中菌落计数方法采用了取1∶50供试液1mL注皿的稀释法（最后5皿合并计数），与采用中国药典2010年版收载的培养基稀释法（取1∶10供试液1mL分注5皿，每皿0.2mL），在每皿中的供试液浓度是一样的，但在方法适用性试验加菌的操作中，提前加到稀释液中，制成的最终浓度供试液就和菌液混合，更实际模拟检验过程中微生物的生长环境特性，而后者是在倾注培养基的时候供试液才与菌液混合，使抑菌成分对微生物的作用可能被培养基部分稀释掩盖了，过程试验对抑菌成分的模拟效果有一定的试验偏差。
结语
新版药典与以往版本的药典相比，计数方法限度采用了指数方式来表示，引入了可接受的最大菌数的概念，针对微生物试验的特性，用数理统计的方法，从给药途径、药品特性、使用方法方面对药品进行风险评估，提高用药的安全性保障。
参考文献
[1]管中玉，赵吉平，马则秀.HPLC法测定天麻丸中天麻素的含量[J].湖南中医杂志，2010，26（4）：121-122.
[2]张金恒.天麻素定量方法概况[J].山西医药杂志（下半月刊），2012，41（1）：20-21.
关键词：微生物限度检查;天麻丸;中国药典
天麻丸在中成药品种涵盖范围之内，其中包含10味中药材，主要涉及到天麻、羌活、独活、地黄等，在此基础上进行加工可实现对成水蜜丸，小蜜丸和大蜜丸的有效炼制，现阶段市场内一般销售的品种为水蜜丸以及大蜜丸。加入适当的生药原粉是中成药丸剂的主要生产工艺，这也是药品安全高度重视，微生物的负载和污染菌的状况的主要原因。最新版中国药典与传统药典相比有相当大的变化，在实际试验过程注意对其进行科学借鉴。
一、仪器、材料与样品
1.仪器
Thermo1378生物安全柜;InterScienceS500自动菌落计数器;ThermoIGS180培养箱;SanyoMIR254生化培养箱;TomySX-700高压灭菌器。
2.培养基
大豆酪蛋白胨琼脂培养基，大豆酪蛋白胨液体培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基，肠道菌增菌液体培养基，麦康凯肉汤培养基等都可在这一试验中进行使用，注意结合实际与试验要求也可科学选择，麦康凯琼脂培养基，紫红胆盐葡萄糖琼脂，RV沙门菌增菌肉汤培养基，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂，三糖铁琼脂等培养基。
需要注意的是上述培养基的提供单位都为广东环凯微生物科技有限公司生产。北京三药科技开发公司所提供的培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基。在实际使用之前我们必须针对培养基进行严格的适用性检查，检查结果符合相关标准与要求的才可以真正投入使用。
3.菌种
金黄色葡萄球菌（S.aureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）[CMCC（B）63501]大肠埃希菌（E.coli）[CMCC（B）44102]白色念珠菌（C.albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（A.niger）[CMCC（F）98003]、乙型副伤寒沙门菌（S.paratyphiB）[CMCC（B）50094]均来自中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心，试验菌为第3代菌株。
二、方法与结果
1.菌液制备
大豆酪蛋白胨液体培养基主要接种对象为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，注意将温度控制在30-35℃范围之间，培养时间为18-24h。沙氏葡萄糖液体培养基接种对象为白色念珠菌接种，需要在20-25℃的范围之内培养2-3d。
黑曲霉主要是在沙氏葡萄糖琼脂培养基中进行接种，其温度也需要控制在20-25℃之间，但其培养时间较长，需要5-7d。在实际针对孢子进行洗脱工作的过程当中我们需要借助0.05%的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。最后将上述菌株制成菌液备用，注意起级别为稀释级，这一过程中所使用的溶液为0.9%无菌氯化钠溶液。
2.实验方法
（1）微生物计数方法适用性试验-平皿法
取供试品10g，加大豆酪蛋白胨液体培养基至100mL，匀浆，静置约5min，取上层液体即为1∶10供试液，取1mL注皿，分别倾注大豆酪蛋白胨琼脂培养基及沙氏葡萄糖琼脂培养基，作为供试品对照组。
另取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加至9.9mL上述供试液，混匀，使每毫升混合液含菌量不大于100cfu，取上述混合液1mL注入平皿，倾注大豆酪蛋白胨琼脂培养基，每个菌株分别制备2个平板，取白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加至9.9mL上述供试液，混匀，使每毫升混合液含菌量不大于100。
（2）微生物计数方法适用性试验———稀释法
制作供试品对照组及菌液组，培养，计数，计算回收比值。2.2.3控制菌检查方法适用性试验耐胆盐革兰阴性菌检查：按照“2.2.1”方法制备1∶10供试液，置20～25℃培养约2h，取相当于供试品0.1、0.01、0.001g的预培养物分别加至10mL的肠道菌增菌液体培养基中，一式2份，其中1份3管每管中加入不大于100cfu的大肠埃希菌，另1份3管每管中加入不大于100cfu的铜绿假单胞菌，按照药典规定方法培养后，每管分别划线接种到紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，培养后观察结果。
三、讨论
考察了4个厂家5个品种的天麻丸的微生物限度检查方法，虽然都是按照中国药典2015年版的处方进行生产，但其产品对微生物的检出有不同程度的干扰现象，部分产品应采用稀释法进行检查，才能顺利检出样品中可能污染的微生物，究其原因，可能与原药材产地、炮制方法、不同辅料对微生物生长环境的影响、还有生产工艺有一定的关系。
说明同一品种不同企业生产的产品不能死搬硬套同一种微生物限度检查法，而应该经过方法适用性确定其可行性;企业生产的同一个品种，在原药材产地、批次、炮制方法以及生产工艺发生改变的时候，也应该进行方法确认其检查方法的可行性;药检所对抽验药品进行检验时，遇到不同企业的产品，在条件许可的情况下，也应尽可能获取相应的检验方法资料。
关于稀释法的操作，本试验中菌落计数方法采用了取1∶50供试液1mL注皿的稀释法（最后5皿合并计数），与采用中国药典2010年版收载的培养基稀释法（取1∶10供试液1mL分注5皿，每皿0.2mL），在每皿中的供试液浓度是一样的，但在方法适用性试验加菌的操作中，提前加到稀释液中，制成的最终浓度供试液就和菌液混合，更实际模拟检验过程中微生物的生长环境特性，而后者是在倾注培养基的时候供试液才与菌液混合，使抑菌成分对微生物的作用可能被培养基部分稀释掩盖了，过程试验对抑菌成分的模拟效果有一定的试验偏差。
结语
新版药典与以往版本的药典相比，计数方法限度采用了指数方式来表示，引入了可接受的最大菌数的概念，针对微生物试验的特性，用数理统计的方法，从给药途径、药品特性、使用方法方面对药品进行风险评估，提高用药的安全性保障。
参考文献
[1]管中玉，赵吉平，马则秀.HPLC法测定天麻丸中天麻素的含量[J].湖南中医杂志，2010，26（4）：121-122.
[2]张金恒.天麻素定量方法概况[J].山西医药杂志（下半月刊），2012，41（1）：20-21.