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目的:应用网络药理学的方法探索中药药对苦参-蛇床子治疗皮肤瘙痒的协同作用机制,并通过体外细胞实验证实二者抗瘙痒的协同作用,为中药复方的机制研究提供新思路。方法:1.基于网络药理学的方法对苦参-蛇床子治疗皮肤瘙痒的潜在协同机制进行预测(1)从中药系统药理数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)中检索得到苦参与蛇床子的化学成分;(2)根据化学成分进行骨架分析,应用骨架注释数据库(Annotated Scaffold Database,ASDB)和药物靶标检索数据库(Pharmaceutical Target Seeker,PTS)对这两味中药的化学成分骨架进行靶标预测;(3)检索治疗靶标数据库(Therapeutic Targets Database,TTD)以及相关文献,收集得到已知的抗瘙痒靶标;(4)对抗瘙痒靶标和预测靶标进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析,获得与抗瘙痒靶标直接或间接相关的预测靶标,然后对这些靶标进行通路分析,得到苦参-蛇床子治疗瘙痒的潜在作用机制。2.提取分离苦参和蛇床子的主要有效部位(1)应用加热回流提取法和超声提取法分别提取苦参与蛇床子的粗提物;(2)采用溶剂处理方法分别富集苦参的黄酮部位和蛇床子的香豆素部位,应用大孔树脂纯化法分离优化苦参的生物碱部位,采用水蒸气蒸馏法提取分离蛇床子的挥发油部位;(3)采用高效液相色谱法分析苦参生物碱部位中苦参碱和氧化苦参碱的含量,苦参黄酮部位中三叶豆紫檀苷和槐属二氢黄酮G的含量,蛇床子香豆素部位中蛇床子素和欧前胡素的含量,为下一步细胞实验提供基础研究数据。3.考察苦参与蛇床子中有效部位和化合物在体外细胞实验中的协同抗炎活性(1)应用MTT法检测苦参和蛇床子的有效部位以及各部位主要化学成分对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的细胞活力影响;(2)建立脂多糖诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的炎症反应模型,以NO炎症因子含量为指标,应用Griess法测定各有效部位以及化合物的协同抗炎活性;(3)选取抗炎效果最显著的有效部位组合或化合物组合,应用Real-time PCR法检测不同药物组合对iNOS、IL-6和COX2相关基因mRNA相对表达量的影响。结果:1.网络药理学分析结果通过数据挖掘,共得到苦参化学成分113个,经过化合物骨架结构解析得到36个有效化合物骨架,预测靶标406个;蛇床子化学成分114个,有效化合物骨架39个,预测靶标416个。获得已知的与抗皮肤瘙痒相关的人源治疗靶标81个,其中有30个预测靶标与已知的抗瘙痒靶标相同(包括IL-2、COX2、ACHE、TRPV1等),与治疗瘙痒直接相关。通过PPI网络分析,获得65个预测靶标与抗瘙痒靶标之间存在着重要的间接作用关系。将直接相关靶标和重要的间接相关靶标合并得95个候选靶标,经通路富集分析,发现这些靶标主要富集于46条KEGG通路,选取其中P-value最小的前20条通路,发现了与瘙痒相关的4条免疫相关通路(toll-like receptor signaling pathway,chemokine signaling pathway,T cell receptor signaling pathway,Fc epsilon RI signaling pathway)和2条神经相关通路(neurotrophin signaling pathway,neuroactive ligand-receptor interaction)。本研究重点关注免疫相关通路,免疫与炎症密切相关,许多免疫因子可激发、诱导和调控炎症反应。该部分结果为之后的细胞实验打下基础。2.化合物含量测定结果苦参中的三叶豆紫檀苷和槐属二氢黄酮G两个黄酮类化合物在质量浓度分别为10.56~84.48μg/mL(R~2=0.9999)、10.76~86.08μg/mL(R~2=0.9999)范围内时与峰面积积分值呈良好线性关系。采用外标峰面积法计算含量,测得苦参黄酮部位中三叶豆紫檀苷的含量为2.68%,RSD=1.70%,槐属二氢黄酮G的含量为6.71%,RSD=1.59%。苦参生物碱部位的氧化苦参碱、苦参碱在质量浓度分别为27.00~216.00μg/mL(R~2=0.9992)、14.48~115.84μg/mL(R~2=0.9998)范围内时与峰面积积分值呈良好线性关系。测得氧化苦参碱的含量为12.48%,RSD=1.32%;苦参生物碱部位苦参碱的含量为2.94%,RSD=0.51%。蛇床子香豆素部位中的蛇床子素和欧前胡素在质量浓度为10.28~82.24μg/mL(R~2=0.9999)、9.36~74.88μg/mL(R~2=0.9999)范围内时与峰面积积分值呈良好线性关系。测得蛇床子素的含量为43.12%,RSD=0.96%;欧前胡素的含量为19.83%,RSD=1.34%。3.苦参-蛇床子的有效部位和主要活性成分协同抗炎的体外细胞实验结果细胞活力检测结果显示,当苦参与蛇床子的各有效部位浓度为12.5μg/mL、6.25μg/mL和3.125μg/mL时,RAW264.7细胞的存活率均大于90%,故确定这三个浓度为给药浓度;各提取物的抗炎活性结果显示,苦参中黄酮部位的抗炎活性最好,其在浓度为12.5μg/mL时平均NO抑制率为49.78%;蛇床子中的香豆素部位具有较好的抗炎活性,其在浓度为12.5μg/mL时平均NO抑制率26.51%;将苦参黄酮部位和蛇床子香豆素部位配伍应用,在浓度为12.5μg/mL时其平均NO含量抑制率达到84.68%;Real-time PCR的结果显示,在浓度为6.25μg/mL时,苦参的黄酮部位配伍蛇床子的香豆素部位可显著下调iNOS、IL-6和COX2基因的mRNA相对表达量。通过细胞活力测试结果选取10μM、5μM、2.5μM三个浓度作为化合物的给药浓度;化合物的抗炎结果显示,苦参黄酮部位的槐属二氢黄酮G在浓度为10μM时对NO含量的抑制率达到51.63%,在化合物中的抗炎效果最显著;蛇床子中香豆素部位的欧前胡素具有相对较好抗炎活性,在10μM时对NO含量平均抑制率达到30.33%;槐属二氢黄酮G和欧前胡素的协同抗炎结果显示,在10μM时该组合对NO含量平均抑制率达到78.45%,该抑制作用显著高于阳性药(10μM槲皮素,NO含量平均抑制率为51.13%)及任一单体化合物;Real-time PCR的结果显示,两化合物配伍应用时,对COX2、IL-6的mRNA相对表达量均有显著的下调作用。结论:1.通过网络药理学的方法分析得到苦参-蛇床子可能主要通过作用于免疫相关通路及神经相关通路协同治疗皮肤瘙痒。2.苦参与蛇床子配伍应用皮肤瘙痒时,苦参的黄酮部位和蛇床子的香豆素部位起到主要作用,两部位协同抗炎效果最好。3.苦参黄酮部位的槐属二氢黄酮G配伍蛇床子香豆素部位的欧前胡素应用于炎症时,其NO含量抑制率显著高于任一化合物以及阳性药物槲皮素。4.苦参和蛇床子主要通过降低IL-6和COX2相关炎症基因的表达从而抑制皮肤瘙痒。