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银黄颗粒具有清热、解毒、消炎的功能。临床上用于急慢性扁桃体炎、急慢性咽喉炎、上呼吸道感染等。被收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第六册,是由金银花和黄芩的提取物制成的复方制剂,含有绿原酸[1]。标准中未收载含量测定方法。本文采用HPLC法测定绿原酸含量,方法简便、结果稳定,能够有效控制银黄颗粒的质量。
1 仪器与试剂
8810型高效液相色谱仪(美国SP公司);SP100型紫外检测器;HW色谱工作站(HW-2000);AE240型电子天平(瑞士梅特勒);绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号:110753-200413);甲醇为色谱纯;水为纯化水;其余试剂均为分析纯;银黄颗粒(市售样品,批号见表2)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件。色谱柱:Thermo Hypersil-Keystone C18(4.6×250mm,5μm);流动相:甲醇—0.2mol•L-1磷酸二氢钠溶液(磷酸调PH至2.7±0.1)(4060);检测波长:320nm;流速:1.0ml•min-1;柱温:30℃;进样量:10μl;绿原酸的理论板数4213。
2.2 对照品溶液的制备。精密称取绿原酸对照品10mg,置于100ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用。
2.3 供试品溶液的制备。取本品10袋内容物,混匀,研细,精密称取0.5g置于50ml量瓶中,加入50%甲醇30ml,超声处理30分钟,放置至室温,再加50%甲醇至刻度摇匀,滤过。
2.4 干扰性试验。按银黄颗粒的制法,制成不含金银花的阴性样品,并按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液测定。阴性对照液对测定无干扰。
2.5 线形关系测定。精密量取对照品储备液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl分别进样,按上述色谱条件进行测定,以峰面积为纵坐标,进样量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,回归方程为A=1.4×105C+7.6×104,r=0.9995,在0.1～2μg范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验。取对照品溶液,重复进样5次,按峰面积计算绿原酸的RSD为0.32%。
2.7 重复性试验。取同一批供试品溶液5份,分别精密称定,按供试品溶液制备方法制备并测定,结果绿原酸平均含量为5.6956mg•g-1,RSD为0.45%。
2.8 稳定性试验。精密吸取同一份供试品溶液分别在0、6、12、24小时进样,4次测定绿原酸峰面积的RSD为0.48%;说明供试溶液在24小时内稳定。
2.9 回收率试验。分别称取已知含量的样品(批号为J05016,含量为5.6956mg•g-1)6份,各0.25g,精密称定,分别加入对照品溶液15ml,按供试品溶液制备方法制备并测定,计算回收率,结果见表Ⅰ。
表Ⅰ 样品中绿原酸回收率测定结果
2.10 样品测定。取3个不同厂家的供试品,按供试品溶液的制备方法处理并测定,结果见表Ⅱ。
表Ⅱ 样品含量测定结果(mg•g-1)(n=5)
3 讨 论
3.1 质量控制指标的选择。银黄颗粒组方中,金银花为主药,其主要成分为绿原酸,《中国药典》2005版一部将绿原酸的含量作为控制质量的指标,故选绿原酸作为本方剂的质量控制指标。
3.2 提取方法的考察。经考察,样品超声提取30分钟、40分钟、60分钟,其RSD为0.31%,表明30分钟超声提取可使绿原酸提取完全。
3.3 含量差异的原因。不同厂家生产的银黄颗粒中绿原酸的含量差异较大,差异大的原因可能由于:①药材的产地、收获季节不同;②药材的炮制及颗粒剂的制备工艺造成绿原酸不同程度的损失;③厂家少投料、投次料。
3.4 流动相的选择。试验过程中,笔者曾选用甲醇—水—冰醋酸(50501)[2]、甲醇—0.2mol•L-1磷酸二氢钠(磷酸调PH至2.7±0.1)4456为流动相,均未获得满意的分离效果。经反复试验,本文采用的流动相较为适宜,能得到满意的分离效果。
3.5 本文建立的含量测定方法简便易行、稳定、可靠,能够有效控制银黄颗粒的质量。
参考文献
1 卫生部药品标准[S].中药成方制剂.第六册,1992:169
2 中国药典[S].一部,2005:600
1 仪器与试剂
8810型高效液相色谱仪(美国SP公司);SP100型紫外检测器;HW色谱工作站(HW-2000);AE240型电子天平(瑞士梅特勒);绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号:110753-200413);甲醇为色谱纯;水为纯化水;其余试剂均为分析纯;银黄颗粒(市售样品,批号见表2)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件。色谱柱:Thermo Hypersil-Keystone C18(4.6×250mm,5μm);流动相:甲醇—0.2mol•L-1磷酸二氢钠溶液(磷酸调PH至2.7±0.1)(4060);检测波长:320nm;流速:1.0ml•min-1;柱温:30℃;进样量:10μl;绿原酸的理论板数4213。
2.2 对照品溶液的制备。精密称取绿原酸对照品10mg,置于100ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用。
2.3 供试品溶液的制备。取本品10袋内容物,混匀,研细,精密称取0.5g置于50ml量瓶中,加入50%甲醇30ml,超声处理30分钟,放置至室温,再加50%甲醇至刻度摇匀,滤过。
2.4 干扰性试验。按银黄颗粒的制法,制成不含金银花的阴性样品,并按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液测定。阴性对照液对测定无干扰。
2.5 线形关系测定。精密量取对照品储备液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl分别进样,按上述色谱条件进行测定,以峰面积为纵坐标,进样量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,回归方程为A=1.4×105C+7.6×104,r=0.9995,在0.1～2μg范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验。取对照品溶液,重复进样5次,按峰面积计算绿原酸的RSD为0.32%。
2.7 重复性试验。取同一批供试品溶液5份,分别精密称定,按供试品溶液制备方法制备并测定,结果绿原酸平均含量为5.6956mg•g-1,RSD为0.45%。
2.8 稳定性试验。精密吸取同一份供试品溶液分别在0、6、12、24小时进样,4次测定绿原酸峰面积的RSD为0.48%;说明供试溶液在24小时内稳定。
2.9 回收率试验。分别称取已知含量的样品(批号为J05016,含量为5.6956mg•g-1)6份,各0.25g,精密称定,分别加入对照品溶液15ml,按供试品溶液制备方法制备并测定,计算回收率,结果见表Ⅰ。
表Ⅰ 样品中绿原酸回收率测定结果
2.10 样品测定。取3个不同厂家的供试品,按供试品溶液的制备方法处理并测定,结果见表Ⅱ。
表Ⅱ 样品含量测定结果(mg•g-1)(n=5)
3 讨 论
3.1 质量控制指标的选择。银黄颗粒组方中,金银花为主药,其主要成分为绿原酸,《中国药典》2005版一部将绿原酸的含量作为控制质量的指标,故选绿原酸作为本方剂的质量控制指标。
3.2 提取方法的考察。经考察,样品超声提取30分钟、40分钟、60分钟,其RSD为0.31%,表明30分钟超声提取可使绿原酸提取完全。
3.3 含量差异的原因。不同厂家生产的银黄颗粒中绿原酸的含量差异较大,差异大的原因可能由于:①药材的产地、收获季节不同;②药材的炮制及颗粒剂的制备工艺造成绿原酸不同程度的损失;③厂家少投料、投次料。
3.4 流动相的选择。试验过程中,笔者曾选用甲醇—水—冰醋酸(50501)[2]、甲醇—0.2mol•L-1磷酸二氢钠(磷酸调PH至2.7±0.1)4456为流动相,均未获得满意的分离效果。经反复试验,本文采用的流动相较为适宜,能得到满意的分离效果。
3.5 本文建立的含量测定方法简便易行、稳定、可靠,能够有效控制银黄颗粒的质量。
参考文献
1 卫生部药品标准[S].中药成方制剂.第六册,1992:169
2 中国药典[S].一部,2005:600