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摘 要:本文采用高校液相测定了桑椹颗粒中绿原酸的含量,固定相为:安捷伦Cl8(4.6mm×250mm,5um),乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸 (10:10:80)为流动相,检测波长为325nm,流速1.0mL·min-1,柱温:30℃。绿原酸在0.01~3.2mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。绿原酸的平均回收率为99.6%,RSD为0.88%;此方法简便、准确、重现性好,可用于桑椹颗粒中绿原酸的含量测定。
关键词:桑椹颗粒;绿原酸;含量
桑椹颗粒滋阴益肾,补血润燥。桑椹颗粒用于阴亏血燥引起的腰膝酸软,眩晕失眠,目昏耳鸣,肠燥便秘,口干舌燥,须发早白。桑葚子别名桑实、文武实、黑椹、桑枣、桑果等,为桑科落叶乔木桑树的成熟果实。桑葚子具有滋阴养血、生津、润肠的功效。《本草衍义》记载:“桑根白皮条中言:桑之用稍备;然独遗乌椹,桑之精英尽在于此。”桑葚子含有鞣酸(tannic acid)、苹果酸(malicacid)、维生素(vitamin)B1、油酸(oleic acid)、辛酸(caprylic acid)、肉豆蔻酸(myris-tic acid)、牻儿醇(geraniol)、芳樟醇(linalool)、a-蒎烯(α-pinene)等。本文采用高校液相测定了桑椹颗粒中绿原酸的含量。
1 仪器与试药
电子天平FA1004型(南京华欣分析仪器制造有限公司);LU230四元低压梯度液相色谱分析系统(大连依利特分析仪器有限公司);司);EasyGuard保护柱(岛津技迩上海商贸有限公司);BT-V20A/B高精度恒温水槽(上海百典仪器设备有限公司);PH510台式精密酸度计(安莱立思仪器科技(上海)有限公司);美国泽拉布Super超越系列全触屏超纯水系统(上海和泰仪器有限公司);Globus超声波萃取设备(赛普泰克有限公司(上海比朗仪器制造有限公司);UV-5500(PC)扫描型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)。绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈(河南萨默生物科技有限公司)、乙酸铵(天津市彪仕奇科技发展有限公司)、甲醇(天津市彪仕奇科技发展有限公司)、醋酸铵(南京化学试剂股份有限公司)、醋酸(河南萨默生物科技有限公司)、磷酸(南京化学试剂股份有限公司)、三乙胺(南京化学试剂股份有限公司)、磷酸二氢铵(南京化学试剂股份有限公司)。
2 含量测定
2.1 色谱条件:依据查阅文献及考查的结果,确定色谱条件如下[1-5]。色谱柱为安捷伦Cl8规格为(4.6mm×250mm,5um);乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸(10:10:80)为流动相;检测波长为325nm。理论板数按绿原酸峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取桑椹颗粒,研细,精密称取,精密加入流动相30mL,超声提取5分钟,放冷,过滤,滤液转移至50毫升容量瓶内用流动相定容,摇匀,即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品约10mg,用流动相溶解并稀释成每1ml中含0.2mg的溶液,作为对照溶液。
2.4 阴性溶液的制备
依照处方取桑椹颗粒辅料,按样品制备工艺制成阴性对照样品,照供试品溶液的制备方法制成阴性液,依上述方法測定,结果在绿原酸出峰处阴性液无色谱峰,结果阴性试验没有干扰,表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg·mL-1的对照品溶液,分别精密吸取10μL注入HPLC,记录色谱图。以峰面积积分值A(μg)为横坐标,进样量为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。试验表明,绿原酸对照品在0.01~3.2mg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.4项下制备对照品溶液,精密吸取绿原酸对照品溶液10μL重复进样6次,测定峰面积积分值,对照品峰面积积分值的RSD为0.63%。结果表明,本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批桑椹颗粒样品6份,分别依照2.2项下供试品制0.89%,结果表明,此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.2项下供试品制备方法制备供试品溶液,分别在0,0.2,0.,4,0.6、0.8、1.0小时精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪,进样测定,供试品绿原酸峰面积积分值的RSD为0.86%。结果表明绿原酸至少在1小时内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验,取已知含量的同一批供试品各6份,精密称定,分精密添加一定量的绿原酸对照品,按供试品制备所述方法制备供试品溶液,测定含量(同时测定样品含量),计算回收率。6次测定的平均回收率为99.6%,RSD为0.88%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法,测定桑椹颗粒三批样品中绿原酸的含量,含量分别为0.18mg/g、0.23mg/g、0.21mg/g。
3 讨论
分别考察乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸(10:10:80),乙腈-0.2%(质量分数)磷酸(体积比25:75),乙腈-甲醇-水(10:1:89)(用磷酸调PH值为6.0),甲醇-0.1%磷酸溶液(30:70),甲醇-异丙醇-乙腈(37∶61∶2),0.2%三乙胺溶液(用磷酸调pH至5.3)-乙腈(65∶35),0.045mol.L-1磷酸二氢铵溶液-乙腈(2∶1)(用三乙胺调pH值至6.5),0.1mol/L磷酸二氢铵溶液(三乙胺调节pH6.6)-乙腈(70:30),乙腈-甲醇-水(10:5:85)(用磷酸调PH值为6.0),水-甲醇-三乙胺(60∶40:0.01),0.1mol.L-1磷酸二氢铵溶液(三乙胺调节pH6.5)-乙腈(75∶25)不同比例的流动相,结果以乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸(10:10:80)为流动相,供试品各峰分离效果最好,故选用乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸(10:10:80)为流动相。此方法简便、准确、重现性好,可用于桑椹颗粒中绿原酸的含量测定。桑椹颗粒中绿原酸的含量应为标示量的95-105%。
参考文献
[1]库尔班江,苏文琴,张鹏威.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量[J].时珍国医国药,2008(06).
[2]金则新,李钧敏,朱小燕.夏蜡梅总黄酮、总绿原酸含量及其环境因子相关性分析[J].浙江大学学报(理学版),2007(04).
[3]彭密军,张敏,刘建兰,周春山.高效液相色谱法测定杜仲颗粒中京尼平苷酸和绿原酸的含量[J].中国医院药学杂志,2005(04).
[4]于华忠,李国章,李贵,罗丽梅.不同品种忍冬及不同部位中绿原酸的含量测定[J].食品研究与开发,2004(06).
[5]王天志,李永梅,王志霄.金银花中3种有机酸的反相高效液相色谱法定量分析[J].药物分析杂志,2000(05).
关键词:桑椹颗粒;绿原酸;含量
桑椹颗粒滋阴益肾,补血润燥。桑椹颗粒用于阴亏血燥引起的腰膝酸软,眩晕失眠,目昏耳鸣,肠燥便秘,口干舌燥,须发早白。桑葚子别名桑实、文武实、黑椹、桑枣、桑果等,为桑科落叶乔木桑树的成熟果实。桑葚子具有滋阴养血、生津、润肠的功效。《本草衍义》记载:“桑根白皮条中言:桑之用稍备;然独遗乌椹,桑之精英尽在于此。”桑葚子含有鞣酸(tannic acid)、苹果酸(malicacid)、维生素(vitamin)B1、油酸(oleic acid)、辛酸(caprylic acid)、肉豆蔻酸(myris-tic acid)、牻儿醇(geraniol)、芳樟醇(linalool)、a-蒎烯(α-pinene)等。本文采用高校液相测定了桑椹颗粒中绿原酸的含量。
1 仪器与试药
电子天平FA1004型(南京华欣分析仪器制造有限公司);LU230四元低压梯度液相色谱分析系统(大连依利特分析仪器有限公司);司);EasyGuard保护柱(岛津技迩上海商贸有限公司);BT-V20A/B高精度恒温水槽(上海百典仪器设备有限公司);PH510台式精密酸度计(安莱立思仪器科技(上海)有限公司);美国泽拉布Super超越系列全触屏超纯水系统(上海和泰仪器有限公司);Globus超声波萃取设备(赛普泰克有限公司(上海比朗仪器制造有限公司);UV-5500(PC)扫描型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)。绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈(河南萨默生物科技有限公司)、乙酸铵(天津市彪仕奇科技发展有限公司)、甲醇(天津市彪仕奇科技发展有限公司)、醋酸铵(南京化学试剂股份有限公司)、醋酸(河南萨默生物科技有限公司)、磷酸(南京化学试剂股份有限公司)、三乙胺(南京化学试剂股份有限公司)、磷酸二氢铵(南京化学试剂股份有限公司)。
2 含量测定
2.1 色谱条件:依据查阅文献及考查的结果,确定色谱条件如下[1-5]。色谱柱为安捷伦Cl8规格为(4.6mm×250mm,5um);乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸(10:10:80)为流动相;检测波长为325nm。理论板数按绿原酸峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取桑椹颗粒,研细,精密称取,精密加入流动相30mL,超声提取5分钟,放冷,过滤,滤液转移至50毫升容量瓶内用流动相定容,摇匀,即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品约10mg,用流动相溶解并稀释成每1ml中含0.2mg的溶液,作为对照溶液。
2.4 阴性溶液的制备
依照处方取桑椹颗粒辅料,按样品制备工艺制成阴性对照样品,照供试品溶液的制备方法制成阴性液,依上述方法測定,结果在绿原酸出峰处阴性液无色谱峰,结果阴性试验没有干扰,表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg·mL-1的对照品溶液,分别精密吸取10μL注入HPLC,记录色谱图。以峰面积积分值A(μg)为横坐标,进样量为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。试验表明,绿原酸对照品在0.01~3.2mg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.4项下制备对照品溶液,精密吸取绿原酸对照品溶液10μL重复进样6次,测定峰面积积分值,对照品峰面积积分值的RSD为0.63%。结果表明,本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批桑椹颗粒样品6份,分别依照2.2项下供试品制0.89%,结果表明,此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.2项下供试品制备方法制备供试品溶液,分别在0,0.2,0.,4,0.6、0.8、1.0小时精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪,进样测定,供试品绿原酸峰面积积分值的RSD为0.86%。结果表明绿原酸至少在1小时内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验,取已知含量的同一批供试品各6份,精密称定,分精密添加一定量的绿原酸对照品,按供试品制备所述方法制备供试品溶液,测定含量(同时测定样品含量),计算回收率。6次测定的平均回收率为99.6%,RSD为0.88%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法,测定桑椹颗粒三批样品中绿原酸的含量,含量分别为0.18mg/g、0.23mg/g、0.21mg/g。
3 讨论
分别考察乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸(10:10:80),乙腈-0.2%(质量分数)磷酸(体积比25:75),乙腈-甲醇-水(10:1:89)(用磷酸调PH值为6.0),甲醇-0.1%磷酸溶液(30:70),甲醇-异丙醇-乙腈(37∶61∶2),0.2%三乙胺溶液(用磷酸调pH至5.3)-乙腈(65∶35),0.045mol.L-1磷酸二氢铵溶液-乙腈(2∶1)(用三乙胺调pH值至6.5),0.1mol/L磷酸二氢铵溶液(三乙胺调节pH6.6)-乙腈(70:30),乙腈-甲醇-水(10:5:85)(用磷酸调PH值为6.0),水-甲醇-三乙胺(60∶40:0.01),0.1mol.L-1磷酸二氢铵溶液(三乙胺调节pH6.5)-乙腈(75∶25)不同比例的流动相,结果以乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸(10:10:80)为流动相,供试品各峰分离效果最好,故选用乙腈-甲醇-0.1mol/L冰醋酸(10:10:80)为流动相。此方法简便、准确、重现性好,可用于桑椹颗粒中绿原酸的含量测定。桑椹颗粒中绿原酸的含量应为标示量的95-105%。
参考文献
[1]库尔班江,苏文琴,张鹏威.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量[J].时珍国医国药,2008(06).
[2]金则新,李钧敏,朱小燕.夏蜡梅总黄酮、总绿原酸含量及其环境因子相关性分析[J].浙江大学学报(理学版),2007(04).
[3]彭密军,张敏,刘建兰,周春山.高效液相色谱法测定杜仲颗粒中京尼平苷酸和绿原酸的含量[J].中国医院药学杂志,2005(04).
[4]于华忠,李国章,李贵,罗丽梅.不同品种忍冬及不同部位中绿原酸的含量测定[J].食品研究与开发,2004(06).
[5]王天志,李永梅,王志霄.金银花中3种有机酸的反相高效液相色谱法定量分析[J].药物分析杂志,2000(05).