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摘要：我国是维生素C生产大国，产能占全世界维生素C市场的90%，但随着越来越多的维生素C生产项目上马，市场争夺日趋激烈，众多科研机构也将维生素C项目作为研究热点，积极研发新技术，开发降低企业生产成本、提高维生素C产率的新方法。
关键词：生物合成 维生素C 产量
中图分类号：R977.23 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）06-0000-00
我国作为维生素C的生产大国，其产能占世界维生素C市场的90%，如何进一步巩固我国在维生素C这一国际市场中的优势地位，取得定价话语权是摆在维生素C生产企业面前的一个课题。在破解这个课题的过程中，不断提高企业综合竞争力，特别是掌握维生素C生产过程中出现的新技术新方法，掌握提高维生素C产量的关键方法是各个生产企业的重要任务。
1 菌种改造策略
中科院赵世刚等人运用低能N+离子注入技术对伴生菌巨大芽孢杆菌进行了改造和选育，离子注入后的巨大芽孢杆菌在发酵过程中分泌更多的碱性物质，有利于中和酮古龙酸杆菌产酸过程中逐渐积累的2-KGA，这种环境更有利于酮古龙酸杆菌的生长和产酸；随着空间生物学的蓬勃兴起和迅速发展，空间飞船搭载菌株已成为另一种重要的诱变技术。郭立格等人对“神舟四号”飞船搭载处理的一批产酸菌株进行了筛选，在418株酮古龙酸杆菌中共筛选出4株糖酸转化率提高4%～5%的酮古龙酸杆菌，且部分菌株的发酵周期缩短了20h。清华大学蔡磊等人在酮古龙酸杆菌中过表达叶酸的基因簇，通过验证酮古龙酸杆菌的生物量和糖酸转化率分别提高了18%和14%，在混菌发酵过程中生物量和糖酸转化率分别提高了25%和35%。江南大学陈坚教授课题组通过分别敲除控制伴生菌芽孢杆菌属菌株（巨大芽孢杆菌）中控制产孢的spo0A和spoVFA的基因，改造后的菌株在与酮古龙酸杆菌的混菌发酵中糖酸转化率比未改造前分别降低了33%和70%，酮古龙酸杆菌的菌数分别在两种混菌搭配中相对应的减少了15%和49%，充分说明了伴生菌芽孢杆菌属菌株的产孢过程对帮助酮古龙酸杆菌的生长和产酸有重要作用。由于巨大芽孢杆菌可以在33℃下生长，而酮古龙酸杆菌只能在30℃以下才能保持较好的生理学状态，Yan Bing等人通过离子注入等方法对酮古龙酸杆菌进行改造，获得耐热突变菌株，改造后的耐热菌株与巨大芽孢杆菌搭配混菌发酵，其在33℃时糖酸转化率有了显著提升，达到了94%左右。相关代谢途径研究发现在酮古龙酸杆菌和相关维生素C生产菌株中，存在一种能够将目标产物2-KGA转化为副产物L-艾杜糖酸的2-KGA还原酶，Saito等人对由葡萄糖一步发酵生产2-KGA的重组菌株进行诱变，得到阻断L-艾杜糖酸代谢途径的酮古龙酸杆菌突变菌株，使2-KGA的产量菌提高一倍左右。
2优化培养环境
陈坚教授课题组还通过对发酵培养基中的物质分析，确定了与细胞生物量、糖酸转化率密切相关的物质，包括甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、烟酸、苏氨酸等，并通过最优化方法确定了最佳含量。天津大学高赟等人运用过程分析技术（PAT）策略，对维生素C二步发酵全过程进行了营养组学研究。利用GC-TOFMS和ICP-AES建立了培养基中化学成分和元素的检测体系，运用正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）动态筛选协同促进2-KGA的积累的关键物质变化规律，有助于维生素C工业生产过程可控性的提高。马倩等人发现了在酮古龙酸杆菌纯培养中加入还原型谷胱甘肽，提高反应体系的还原性，能够提高菌体的生物量和产酸能力，通过透射电子显微镜和扫描电镜的观察，发现经还原型谷胱甘肽处理的酮古龙酸杆菌菌体长度增长4-6倍，同时形成了内膜，通过借助蛋白质组学手段，发现还原型谷胱甘肽能够促进酮古龙酸杆菌转运TPP的能力，从而促进PPP和TCA循环，产生更多ATP和NADPH供给细胞代谢，抵抗活性氧攻击。纪凯等人发现金属离子Fe3+、Mn2+和Mg2+有助于细胞生长产酸，通过最优化方法，确定了各种金属离子的最佳浓度。纪凯等人还对不同溶氧浓度对2-KGA关键合成酶活性的影响进行了深入的研究，研究表明高溶氧条件适合菌体生长，而不利于产酸；低溶氧水平菌体有利于菌体产酸，但对菌体生长不利。郑巧双等研究了稀土离子及其配合物对混菌发酵产酸的影响，La3+，Ce3+，Nd3+和Sm3+等稀土离子在较低浓度下有促进2-KGA生成且缩短发酵时间的作用，而EDTA镧、柠檬酸镧等对2-KGA生成有抑制作用。研究表明，酮古龙酸杆菌和巨大芽孢杆菌的生长最适pH值分别是6和8，张静等人通过分阶段控制培养环境pH的策略，控制不同阶段的优势菌种，以实现对2-KGA合成的最佳调控。
3适应性进化策略
邹旸等人以强化两菌相互作用作为切入点，采用混菌适应性进化手段成功的实现了提高2-酮基-L-古龙酸产率的目标，为进一步改造维生素C生产菌株提供了新思路。混菌体系在为期150天的适应性进化过程中快速进化达到稳定状态，表现为2-KGA转化率、pH值、酮古龙酸杆菌菌数和蜡状芽孢杆菌菌数在前50天中较大波动后达到相对稳定的状态。通过对分纯后的酮古龙酸杆菌和蜡状芽孢杆菌单菌进行分析可以发现，经历适应性进化的酮古龙酸杆菌和蜡状芽孢杆菌，对培养基环境的适应能力及生长能力有很大提高，且酮古龙酸杆菌产酸能力有了显著提高，进化150天的酮古龙酸杆菌产酸能力比原始菌株提高了106.4%。对进化后菌株经交叉搭配发酵，表现为最佳混菌组合2-KGA转化率达到了93%，远高于原始菌株的77%。通过代谢水平分析发现，进化后酮古龙酸杆菌、蜡状芽孢杆菌与原始菌株相比存在明显的代谢差异，进化后两菌相互配合更加协调，对胞内营养物质的利用能力逐渐提高，有助于目标产物2-KGA的生成。
4结语
以上研究为在混菌中达到提高目标产物产量这一目的提供了新的例证，为进一步优化维生素C生产工艺、提高维生素C产量提供了新思路。
参考文献
[1]赵世刚，王陶，余曾亮.维生索C二步发酵中离子注入诱变巨大芽孢杆菌的生物学效应[J].激光生物学报，2007，16（4）：455-459.
[2]郭立格，刘其友，杨润蕾等.从空间搭载Vc生产菌株中筛选高产菌株[J].河北大学学报（自然科学版），2004，24（3）：284-288.
收稿日期：2015-02-10
作者简介：邹旸（1985—），男，汉族，天津人，博士研究生，工程师，研究方向：食品科学。
关键词：生物合成 维生素C 产量
中图分类号：R977.23 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）06-0000-00
我国作为维生素C的生产大国，其产能占世界维生素C市场的90%，如何进一步巩固我国在维生素C这一国际市场中的优势地位，取得定价话语权是摆在维生素C生产企业面前的一个课题。在破解这个课题的过程中，不断提高企业综合竞争力，特别是掌握维生素C生产过程中出现的新技术新方法，掌握提高维生素C产量的关键方法是各个生产企业的重要任务。
1 菌种改造策略
中科院赵世刚等人运用低能N+离子注入技术对伴生菌巨大芽孢杆菌进行了改造和选育，离子注入后的巨大芽孢杆菌在发酵过程中分泌更多的碱性物质，有利于中和酮古龙酸杆菌产酸过程中逐渐积累的2-KGA，这种环境更有利于酮古龙酸杆菌的生长和产酸；随着空间生物学的蓬勃兴起和迅速发展，空间飞船搭载菌株已成为另一种重要的诱变技术。郭立格等人对“神舟四号”飞船搭载处理的一批产酸菌株进行了筛选，在418株酮古龙酸杆菌中共筛选出4株糖酸转化率提高4%～5%的酮古龙酸杆菌，且部分菌株的发酵周期缩短了20h。清华大学蔡磊等人在酮古龙酸杆菌中过表达叶酸的基因簇，通过验证酮古龙酸杆菌的生物量和糖酸转化率分别提高了18%和14%，在混菌发酵过程中生物量和糖酸转化率分别提高了25%和35%。江南大学陈坚教授课题组通过分别敲除控制伴生菌芽孢杆菌属菌株（巨大芽孢杆菌）中控制产孢的spo0A和spoVFA的基因，改造后的菌株在与酮古龙酸杆菌的混菌发酵中糖酸转化率比未改造前分别降低了33%和70%，酮古龙酸杆菌的菌数分别在两种混菌搭配中相对应的减少了15%和49%，充分说明了伴生菌芽孢杆菌属菌株的产孢过程对帮助酮古龙酸杆菌的生长和产酸有重要作用。由于巨大芽孢杆菌可以在33℃下生长，而酮古龙酸杆菌只能在30℃以下才能保持较好的生理学状态，Yan Bing等人通过离子注入等方法对酮古龙酸杆菌进行改造，获得耐热突变菌株，改造后的耐热菌株与巨大芽孢杆菌搭配混菌发酵，其在33℃时糖酸转化率有了显著提升，达到了94%左右。相关代谢途径研究发现在酮古龙酸杆菌和相关维生素C生产菌株中，存在一种能够将目标产物2-KGA转化为副产物L-艾杜糖酸的2-KGA还原酶，Saito等人对由葡萄糖一步发酵生产2-KGA的重组菌株进行诱变，得到阻断L-艾杜糖酸代谢途径的酮古龙酸杆菌突变菌株，使2-KGA的产量菌提高一倍左右。
2优化培养环境
陈坚教授课题组还通过对发酵培养基中的物质分析，确定了与细胞生物量、糖酸转化率密切相关的物质，包括甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、烟酸、苏氨酸等，并通过最优化方法确定了最佳含量。天津大学高赟等人运用过程分析技术（PAT）策略，对维生素C二步发酵全过程进行了营养组学研究。利用GC-TOFMS和ICP-AES建立了培养基中化学成分和元素的检测体系，运用正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）动态筛选协同促进2-KGA的积累的关键物质变化规律，有助于维生素C工业生产过程可控性的提高。马倩等人发现了在酮古龙酸杆菌纯培养中加入还原型谷胱甘肽，提高反应体系的还原性，能够提高菌体的生物量和产酸能力，通过透射电子显微镜和扫描电镜的观察，发现经还原型谷胱甘肽处理的酮古龙酸杆菌菌体长度增长4-6倍，同时形成了内膜，通过借助蛋白质组学手段，发现还原型谷胱甘肽能够促进酮古龙酸杆菌转运TPP的能力，从而促进PPP和TCA循环，产生更多ATP和NADPH供给细胞代谢，抵抗活性氧攻击。纪凯等人发现金属离子Fe3+、Mn2+和Mg2+有助于细胞生长产酸，通过最优化方法，确定了各种金属离子的最佳浓度。纪凯等人还对不同溶氧浓度对2-KGA关键合成酶活性的影响进行了深入的研究，研究表明高溶氧条件适合菌体生长，而不利于产酸；低溶氧水平菌体有利于菌体产酸，但对菌体生长不利。郑巧双等研究了稀土离子及其配合物对混菌发酵产酸的影响，La3+，Ce3+，Nd3+和Sm3+等稀土离子在较低浓度下有促进2-KGA生成且缩短发酵时间的作用，而EDTA镧、柠檬酸镧等对2-KGA生成有抑制作用。研究表明，酮古龙酸杆菌和巨大芽孢杆菌的生长最适pH值分别是6和8，张静等人通过分阶段控制培养环境pH的策略，控制不同阶段的优势菌种，以实现对2-KGA合成的最佳调控。
3适应性进化策略
邹旸等人以强化两菌相互作用作为切入点，采用混菌适应性进化手段成功的实现了提高2-酮基-L-古龙酸产率的目标，为进一步改造维生素C生产菌株提供了新思路。混菌体系在为期150天的适应性进化过程中快速进化达到稳定状态，表现为2-KGA转化率、pH值、酮古龙酸杆菌菌数和蜡状芽孢杆菌菌数在前50天中较大波动后达到相对稳定的状态。通过对分纯后的酮古龙酸杆菌和蜡状芽孢杆菌单菌进行分析可以发现，经历适应性进化的酮古龙酸杆菌和蜡状芽孢杆菌，对培养基环境的适应能力及生长能力有很大提高，且酮古龙酸杆菌产酸能力有了显著提高，进化150天的酮古龙酸杆菌产酸能力比原始菌株提高了106.4%。对进化后菌株经交叉搭配发酵，表现为最佳混菌组合2-KGA转化率达到了93%，远高于原始菌株的77%。通过代谢水平分析发现，进化后酮古龙酸杆菌、蜡状芽孢杆菌与原始菌株相比存在明显的代谢差异，进化后两菌相互配合更加协调，对胞内营养物质的利用能力逐渐提高，有助于目标产物2-KGA的生成。
4结语
以上研究为在混菌中达到提高目标产物产量这一目的提供了新的例证，为进一步优化维生素C生产工艺、提高维生素C产量提供了新思路。
参考文献
[1]赵世刚，王陶，余曾亮.维生索C二步发酵中离子注入诱变巨大芽孢杆菌的生物学效应[J].激光生物学报，2007，16（4）：455-459.
[2]郭立格，刘其友，杨润蕾等.从空间搭载Vc生产菌株中筛选高产菌株[J].河北大学学报（自然科学版），2004，24（3）：284-288.
收稿日期：2015-02-10
作者简介：邹旸（1985—），男，汉族，天津人，博士研究生，工程师，研究方向：食品科学。