探讨异体皮肤成纤维细胞(Fb)在促进糖尿病小鼠创面愈合中的作用及其机制。
方法(1)实验1。取糖尿病小鼠及健康小鼠各10只，处死后取背部皮肤组织，制备第4代正常皮肤Fb及糖尿病皮肤Fb悬液。另取27只糖尿病小鼠，按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组，每组9只，于背部制作面积为1 cm×1 cm的全层皮肤缺损创面。伤后即刻，分别于正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠创面4个角注射制备的正常皮肤Fb和糖尿病皮肤Fb悬液各200 μL，PBS组小鼠分别于相同位置注射等量PBS。伤后3、7、10、14、17 d，取3组存活小鼠进行创面大体观察并计算创面愈合率。伤后7、14 d，每组各取行创面大体观察后的3只小鼠处死，取创面组织。免疫荧光法检测创面组织Ki－67阳性细胞百分比，免疫组织化学法检测创面组织微血管密度(MVD)，Masson染色检测创面组织胶原纤维沉积量。(2)实验2。取糖尿病小鼠及健康小鼠各10只，同实验1制备原代、第4代正常皮肤Fb及原代、第4代糖尿病皮肤Fb。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞转化生长因子β1(TGF－β1)、晚期糖基化终末产物(AGE)、基质金属蛋白酶9(MMP－9)、神经激肽1的mRNA和蛋白表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析及LSD－t检验。
结果(1)正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠伤后各时间点创面干燥、结痂速度较PBS组快。伤后17 d，正常皮肤Fb组小鼠创面愈合率与PBS组相近(t＝3.45，P>0.05)，其余各时间点正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠创面愈合率明显高于PBS组(t＝9.15、10.25、35.28、6.79、8.37、10.69、22.53、6.70、4.47，P<0.05或P<0.01)。伤后7、14 d，正常皮肤Fb组小鼠创面愈合率明显高于糖尿病皮肤Fb组(t＝4.41、4.16，P<0.05)。伤后7、14 d，正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠创面组织Ki－67阳性细胞百分比明显高于PBS组(t＝20.89、31.82、4.86、29.53，P<0.05或P<0.01)，正常皮肤Fb组小鼠创面组织Ki－67阳性细胞百分比明显高于糖尿病皮肤Fb组(t＝8.78、13.51，P<0.05或P<0.01)。伤后7、14 d，正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠创面组织MVD明显高于PBS组(t＝26.92、56.42、10.36、26.85，P<0.01)。伤后14 d，正常皮肤Fb组小鼠创面组织MVD明显高于糖尿病皮肤Fb组(t＝8.61，P<0.01)。伤后7、14 d，正常皮肤Fb组小鼠创面组织胶原纤维沉积量明显高于糖尿病皮肤Fb组及PBS组(t＝10.09、5.48、4.77、3.14，P<0.05或P<0.01)。(2)原代正常皮肤Fb凋亡率为(5.61±0.18)%，与第4代正常皮肤Fb凋亡率相近[(6.48±0.16)%，t＝1.44，P＝0.06]。原代糖尿病皮肤Fb凋亡率为(26.25±0.56)%，明显高于原代正常皮肤Fb(t＝36.61，P<0.01)，与第4代糖尿病皮肤Fb相近[(25.68±0.93)%，t＝0.91，P＝0.41]。原代正常皮肤Fb的TGF－β1及神经激肽1 mRNA表达量明显高于原代糖尿病皮肤Fb(t＝25.25、273.30，P<0.01)，AGE及MMP－9 mRNA表达量明显低于原代糖尿病皮肤Fb(t＝23.01、8.84，P<0.05或P<0.01)。原代糖尿病皮肤Fb的TGF－β1、AGE及神经激肽1 mRNA表达量明显高于第4代糖尿病皮肤Fb(t＝4.34、22.84、12.10，P<0.05或P<0.01)。原代正常皮肤Fb的TGF－β1及神经激肽1蛋白表达量明显高于原代糖尿病皮肤Fb(t＝4.61、8.53，P<0.05)，AGE及MMP－9蛋白表达量明显低于原代糖尿病皮肤Fb(t＝10.22、29.90，P<0.01)。原代糖尿病皮肤Fb的AGE及神经激肽1蛋白表达量明显高于第4代糖尿病皮肤Fb(t＝8.09、4.36，P<0.05或P<0.01)。
结论异体皮肤Fb可通过促进创面Fb增殖、血管生成、胶原纤维沉积等促进糖尿病小鼠创面愈合，而小鼠糖尿病皮肤Fb在脱离糖尿病微环境进行体外培养后，细胞活性低于正常皮肤Fb，因而促进创面愈合的作用不如正常皮肤Fb。