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摘 要：研究用不同浓度的秋水仙素（0.002%、0.01%、0.02%、0.1%、0.2%）对花生种子进行不同时间（2h、4h、6h、8h、10h）的诱导处理，分析种子发芽率及生长速率受秋水仙素浓度和作用时间的影响，并对花生根尖细胞的倍性进行鉴定。结果表明：秋水仙素对花生种子的发芽率和生长速率有显著的抑制作用，抑制作用随秋水仙素浓度和作用时间的增加而递增；诱导花生多倍体的最佳作用浓度和作用时间为0.01%秋水仙素处理4h或者0.02%秋水仙素处理2h。
关键词：秋水仙素；花生；发芽率；生长速率
中图分类号 S565 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）12-0036-02
Induction Effect of Colchicine on Peanut
Mei Hui1 et al.
（1Department of Bioscience and Biotechnology，Wuhan Institute of Bioengineering，Wuhan 430415，China）
Abstract：With different concentrations of colchicine（0.002%，0.01%，0.02%，0.1%，0.2%）on peanut seeds of different time（2h，4h，6h，8h，10h）treatment induced，analysed the effect of colchicine concentration and action time of germination rate and the growth rate of peanut seeds，and also the root tip cells were identified.The results showed that there was significant inhibitory effect of colchicine on germination ratio and growth rate of peanut，and the inhibition was increased by increasing the concentration and action time of colchicine.The optimal concentration and time of induction of polyploid peanut is 0.01%/4h or 0.02%/2h.
Key words：Colchicine；Peanut；Germination ratio；Growth rate
多倍体在植物界广泛存在，多倍体植物由于染色体组加倍导致细胞内含物增加，往往表现出形态增大、营养物质增加、抗逆性增强等特点[1]。多倍体育种是植物育种的重要方向，已在白菜、西瓜、杨树等多种植物中广泛应用[2-4]。多倍体诱导常采用秋水仙素对植物种子或者生长点进行处理，处理效果因秋水仙素浓度、作用时间及植物种类、器官等而呈现差异，研究表明，经秋水仙素处理后，花生种子的诱导率和存活率均显著高于其它外植体[5]。花生栽培种为异源四倍体（2n=4x=40），包括两个染色体组[6]。本实验用不同浓度的秋水仙素对花生种子进行了不同时间的诱导处理，通过倍性鉴定及种子发芽率、生长速率的差异，找出最佳秋水仙素处理浓度及作用时间，为今后花生的多倍体育种及优良花生品种的选育奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂 花生种子由中国农业科学院油料作物研究所惠赠；秋水仙素购自上海悠祥生化试剂有限公司；纤维素酶、果胶酶购自武汉市华顺生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 多倍体诱导 通过种子浸渍法用秋水仙素溶液处理花生种子进行多倍体诱导。用不同浓度秋水仙素与不同浸渍时间处理结合，找出秋水仙素与花生的发芽率及生长速率之间的关系。秋水仙素浓度为0.2%、0.1%、0.02%、0.01%、0.002%，处理时间为2h、4h、6h、8h、10h，秋水仙素溶液量浸泡种子即可，然后清水清洗后沙土培养致花生胚根长到6cm。
1.2.2 生长特性比较 沙土培养7d后，记录种子发芽率（样本数30个），每7d测量一次根部至顶端的高度，记录到第四周截止，比较不同处理组花生的发芽率和生长速率。
1.2.3 花生根尖细胞倍性鉴定 由于花生染色体小且数目多，不易采用传统染色体制片法数染色体数目进行倍性鉴定，此处采用单细胞DNA含量差异进行倍性鉴定。采用去壁低渗火焰干燥法[7]制作分散良好的花生根尖细胞装片，将干燥后的细胞装片进行染色固定，利用DNA含量自动检测仪进行分析（武汉兰丁医学高科技有限公司），分别记录装片上单个细胞核DNA含量的数据，随机选取20个样本数据进行分析，比较不同浓度秋水仙素与不同浸渍时间处理的花生根尖细胞核DNA含量差异，通过定量测定各单个细胞内DNA含量来鉴定花生根尖细胞的倍性。
2 结果与分析
2.1 秋水仙素对花生发芽率的影响 秋水仙素的浓度和作用时间与发芽率之间的关系如图1所示。由图1可知：秋水仙素对花生发芽率有明显的抑制作用，秋水仙素浓度越高，处理时间越长，发芽率越低，0.002%和0.01%浓度的秋水仙素对花生种子的发芽率影响较小；0.02%浓度的秋水随着处理时间的延长，发芽率缓慢下降；0.1%和0.2%浓度的秋水仙素随处理时间的延长，发芽率急剧下降。根据不同浓度秋水仙素随着处理时间的延长对花生发芽率的影响，宜采用0.02%以下浓度秋水仙素处理花生种子，以免因种子发芽率过低而影响实验结果。
2.2 秋水仙素对花生生长速率的影响 对于已发芽的花生植株生长至第四周时测量其株高，秋水仙素的浓度和作用时间与生长速率之间的关系如图2。由图2可知：秋水仙素浓度越高，处理时间越长，花生植株生长越缓慢，说明越水仙素能明显抑制花生植株的生长。根据不同浓度秋水仙素随着处理时间的延长对花生生长速率的影响，处理时间宜在6h以下。 2.3 DNA细胞自动检测分析仪进行倍性鉴定 综合秋水仙素浓度及处理时间对花生发芽率、生长速率的影响，分别采用0.002%、0.01%和0.02%浓度的秋水仙素处理花生种子2h、4h和6h。对制备装片后根尖单细胞的DNA含量进行扫描，扫描样本数为20个单细胞。统计结果如表1所示。由表1可知：秋水仙素处理过的花生根尖细胞DNA含量明显高于空白对照组，0.01%浓度秋水仙素处理4h或者0.02%浓度秋水仙素处理2h即能使花生根尖单细胞DNA含量加倍。因此，秋水仙素处理花生种子使染色体数目加倍，最佳作用浓度和作用时间是0.01%浓度秋水仙素处理4h或者0.02%浓度秋水仙素处理2h。
3 结论
通过用不同浓度和不同作用时间的秋水仙素处理花生种子，结果表明：秋水仙素处理对花生种子的发芽率和生长速率有抑制作用，浓度超过0.02%，作用时间超过6h，发芽率在50%以下，因此处理花生种子的秋水仙素浓度不宜超过0.02%；不同浓度的秋水仙素对花生生长速率的抑制作用都随作用时间的延长而增加，为不影响花生植株的生长，处理时间不宜超过6h；秋水仙素处理花生种子使染色体数目加倍，最佳作用浓度和作用时间是0.01%秋水仙素处理4h或者0.02%秋水仙素处理2h。
参考文献
[1]陶抵辉.植物多倍体的研究与应用[J].生物技术通报，2010（7）：22-27.
[2]钟程.有性多倍化不结球白菜四倍体种质的创制及利用[D].南京：南京农业大学，2011.
[3]施先锋.西瓜多倍体诱导及倍性鉴定的研究[D].武汉：华中农业大学，2007.
[4]费希同，唐军荣，周军，等.中国杨树多倍体诱导研究现状[J].湖北农业科学，2014，53（18）：4252-4256.
[5]Aina O，Quesenberry K，Gallo M.In vitro induction of tetraploids in Arachis paraguariensis[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2012，111（2）：231-238.
[6]金建猛，谷建中，刘向阳，等.花生农艺性状与产量的灰色关联度分析[J].种子科技，2009（05）：31-33.
[7]虢国成，向洋.大麦和玉米染色体去壁低渗法制片及其核型分析[J].大麦与谷类科学，2008（02）：8-11.
（责编：张宏民）
关键词：秋水仙素；花生；发芽率；生长速率
中图分类号 S565 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）12-0036-02
Induction Effect of Colchicine on Peanut
Mei Hui1 et al.
（1Department of Bioscience and Biotechnology，Wuhan Institute of Bioengineering，Wuhan 430415，China）
Abstract：With different concentrations of colchicine（0.002%，0.01%，0.02%，0.1%，0.2%）on peanut seeds of different time（2h，4h，6h，8h，10h）treatment induced，analysed the effect of colchicine concentration and action time of germination rate and the growth rate of peanut seeds，and also the root tip cells were identified.The results showed that there was significant inhibitory effect of colchicine on germination ratio and growth rate of peanut，and the inhibition was increased by increasing the concentration and action time of colchicine.The optimal concentration and time of induction of polyploid peanut is 0.01%/4h or 0.02%/2h.
Key words：Colchicine；Peanut；Germination ratio；Growth rate
多倍体在植物界广泛存在，多倍体植物由于染色体组加倍导致细胞内含物增加，往往表现出形态增大、营养物质增加、抗逆性增强等特点[1]。多倍体育种是植物育种的重要方向，已在白菜、西瓜、杨树等多种植物中广泛应用[2-4]。多倍体诱导常采用秋水仙素对植物种子或者生长点进行处理，处理效果因秋水仙素浓度、作用时间及植物种类、器官等而呈现差异，研究表明，经秋水仙素处理后，花生种子的诱导率和存活率均显著高于其它外植体[5]。花生栽培种为异源四倍体（2n=4x=40），包括两个染色体组[6]。本实验用不同浓度的秋水仙素对花生种子进行了不同时间的诱导处理，通过倍性鉴定及种子发芽率、生长速率的差异，找出最佳秋水仙素处理浓度及作用时间，为今后花生的多倍体育种及优良花生品种的选育奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂 花生种子由中国农业科学院油料作物研究所惠赠；秋水仙素购自上海悠祥生化试剂有限公司；纤维素酶、果胶酶购自武汉市华顺生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 多倍体诱导 通过种子浸渍法用秋水仙素溶液处理花生种子进行多倍体诱导。用不同浓度秋水仙素与不同浸渍时间处理结合，找出秋水仙素与花生的发芽率及生长速率之间的关系。秋水仙素浓度为0.2%、0.1%、0.02%、0.01%、0.002%，处理时间为2h、4h、6h、8h、10h，秋水仙素溶液量浸泡种子即可，然后清水清洗后沙土培养致花生胚根长到6cm。
1.2.2 生长特性比较 沙土培养7d后，记录种子发芽率（样本数30个），每7d测量一次根部至顶端的高度，记录到第四周截止，比较不同处理组花生的发芽率和生长速率。
1.2.3 花生根尖细胞倍性鉴定 由于花生染色体小且数目多，不易采用传统染色体制片法数染色体数目进行倍性鉴定，此处采用单细胞DNA含量差异进行倍性鉴定。采用去壁低渗火焰干燥法[7]制作分散良好的花生根尖细胞装片，将干燥后的细胞装片进行染色固定，利用DNA含量自动检测仪进行分析（武汉兰丁医学高科技有限公司），分别记录装片上单个细胞核DNA含量的数据，随机选取20个样本数据进行分析，比较不同浓度秋水仙素与不同浸渍时间处理的花生根尖细胞核DNA含量差异，通过定量测定各单个细胞内DNA含量来鉴定花生根尖细胞的倍性。
2 结果与分析
2.1 秋水仙素对花生发芽率的影响 秋水仙素的浓度和作用时间与发芽率之间的关系如图1所示。由图1可知：秋水仙素对花生发芽率有明显的抑制作用，秋水仙素浓度越高，处理时间越长，发芽率越低，0.002%和0.01%浓度的秋水仙素对花生种子的发芽率影响较小；0.02%浓度的秋水随着处理时间的延长，发芽率缓慢下降；0.1%和0.2%浓度的秋水仙素随处理时间的延长，发芽率急剧下降。根据不同浓度秋水仙素随着处理时间的延长对花生发芽率的影响，宜采用0.02%以下浓度秋水仙素处理花生种子，以免因种子发芽率过低而影响实验结果。
2.2 秋水仙素对花生生长速率的影响 对于已发芽的花生植株生长至第四周时测量其株高，秋水仙素的浓度和作用时间与生长速率之间的关系如图2。由图2可知：秋水仙素浓度越高，处理时间越长，花生植株生长越缓慢，说明越水仙素能明显抑制花生植株的生长。根据不同浓度秋水仙素随着处理时间的延长对花生生长速率的影响，处理时间宜在6h以下。 2.3 DNA细胞自动检测分析仪进行倍性鉴定 综合秋水仙素浓度及处理时间对花生发芽率、生长速率的影响，分别采用0.002%、0.01%和0.02%浓度的秋水仙素处理花生种子2h、4h和6h。对制备装片后根尖单细胞的DNA含量进行扫描，扫描样本数为20个单细胞。统计结果如表1所示。由表1可知：秋水仙素处理过的花生根尖细胞DNA含量明显高于空白对照组，0.01%浓度秋水仙素处理4h或者0.02%浓度秋水仙素处理2h即能使花生根尖单细胞DNA含量加倍。因此，秋水仙素处理花生种子使染色体数目加倍，最佳作用浓度和作用时间是0.01%浓度秋水仙素处理4h或者0.02%浓度秋水仙素处理2h。
3 结论
通过用不同浓度和不同作用时间的秋水仙素处理花生种子，结果表明：秋水仙素处理对花生种子的发芽率和生长速率有抑制作用，浓度超过0.02%，作用时间超过6h，发芽率在50%以下，因此处理花生种子的秋水仙素浓度不宜超过0.02%；不同浓度的秋水仙素对花生生长速率的抑制作用都随作用时间的延长而增加，为不影响花生植株的生长，处理时间不宜超过6h；秋水仙素处理花生种子使染色体数目加倍，最佳作用浓度和作用时间是0.01%秋水仙素处理4h或者0.02%秋水仙素处理2h。
参考文献
[1]陶抵辉.植物多倍体的研究与应用[J].生物技术通报，2010（7）：22-27.
[2]钟程.有性多倍化不结球白菜四倍体种质的创制及利用[D].南京：南京农业大学，2011.
[3]施先锋.西瓜多倍体诱导及倍性鉴定的研究[D].武汉：华中农业大学，2007.
[4]费希同，唐军荣，周军，等.中国杨树多倍体诱导研究现状[J].湖北农业科学，2014，53（18）：4252-4256.
[5]Aina O，Quesenberry K，Gallo M.In vitro induction of tetraploids in Arachis paraguariensis[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2012，111（2）：231-238.
[6]金建猛，谷建中，刘向阳，等.花生农艺性状与产量的灰色关联度分析[J].种子科技，2009（05）：31-33.
[7]虢国成，向洋.大麦和玉米染色体去壁低渗法制片及其核型分析[J].大麦与谷类科学，2008（02）：8-11.
（责编：张宏民）