【摘 要】
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目的 建立一种新的敏感、特异且能快速检测细粒棘球绦虫G1的重组酶介导扩增技术(Recombinase aided isothermal amplification,RAA). 方法 以细粒棘球绦虫G1(E.granulosus G1
【机 构】
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中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,国家热带病研究中心,世界卫生组织热带病合作中心,科技部国家级热带病国际联合研究中心,卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室,上海200025
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目的 建立一种新的敏感、特异且能快速检测细粒棘球绦虫G1的重组酶介导扩增技术(Recombinase aided isothermal amplification,RAA). 方法 以细粒棘球绦虫G1(E.granulosus G1,EgG1)线粒体基因序列(GenBank No.AF297617)作为靶序列设计合成引物,以EgG1 DNA为模板进行RAA扩增,反应产物预期大小为284 bp.以聚合酶链式反应(PCR)作为平行对照,应用RAA扩增不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的含目的基因片段不同拷贝数的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测方法的检测灵敏度;应用此方法检测多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、贾第鞭毛虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价方法的特异性.方法优化后用于检测感染EgG1的动物组织标本(10份)、模拟现场阳性犬粪标本(3份)以及现场阳性犬粪标本(5份),以验证该项检测技术的可靠性和实用性. 结果 建立的RAA法可在40 min内特异性扩增EgG1的目的基因片段,最低可检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低检出质粒拷贝数为104个.用建立的RAA法检测其他寄生虫(包括多房棘球绦虫)结果均为阴性.用优化的RAA方法检测感染EgG1的动物组织标本以及阳性粪便标本(包括模拟现场粪便标本),结果均为阳性,且与PCR检测结果一致. 结论 建立的针对EgG1的RAA方法,其具有简便快捷、检测灵敏度与特异性均较好的特点,可望用于细粒棘球绦虫虫种的鉴定以及棘球蚴病基因诊断.
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