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摘要：目的 探討肾虚质与脑功能衰退的相关性及肾藏志理论的物质基础与神经生物学机制。方法 采用“猫吓鼠”造模法造成先天不足加后天失养复合型肾虚模型，随机分为模型组、左归丸组和右归丸组；空白组产自正常孕鼠。对仔鼠恐吓同时开始灌胃，左归丸组、右归丸组分别给予左归丸、右归丸混悬液，空白组和模型组给予等量生理盐水，1次/d，连续2个月。悬吊试验和Y迷宫实验观测大鼠运动和空间学习记忆能力，免疫组化法检测N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚基NR2A、NR2B蛋白表达。结果 悬吊试验：模型组持续时间低于空白组（P<0.05），左归丸组和右归丸组高于模型组（P<0.05）；Y迷宫实验：模型组跑至安全区正确次数低于空白组（P<0.05），左归丸组和右归丸组高于模型组（P<0.05）；模型组NR2A、NR2B光密度值较空白组降低（P<0.05），左归丸组和右归丸组光密度值较模型组升高（P<0.05）。结论 肾虚质大鼠神经行为学异常且海马NMDA受体亚基表达降低；左归丸、右归丸可上调NMDA受体表达且改善大鼠脑功能，揭示了肾虚质与脑功能衰退的相关性及肾藏志理论的物质基础与神经生物学机制。
关键词：肾虚质；悬吊试验；Y迷宫实验；NR2A蛋白；NR2B蛋白；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0052-04
Study on Neurobehavioral Disorders and NMDA Receptor Expression in Rats with Kidney-deficiency Constitution SUN Yu-ru， SUN Yao-guang， ZHANG Qi， WANG Xiao-di， WANG Xing， SUN Li-jun （Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）
Abstract：Objective To discuss the correlation between kidney-deficiency constitution and brain function decline， and material basis of kidney-storing-spirit theory and neurobiology mechanism. Methods By employing the method of “cats scare rats”， composite offspring rat models with deficiency and acquired dystrophy were built， then they were divided into model group， Zuogui Pill group and Yougui Pill group. Blank group was composed from normal pregnant rats. When the intimidation of offspring began， Zuogui Pill and Yougui Pill groups received gavage with corresponding doses of medicine， 1 times per day for 2 consecutive months. Model and blank groups received the same amount of normal saline. Exercise capacity was detected by suspension test. Learning and memory capacity was detected by Y maze test. Expressions of NMDA receptor subunits NR2A and NR2B were detected by immunohistochemical method. Results In suspension test， the duration of model group was shorter than blank group （P<0.05）， while duration of Zuogui Pill and Yougui Pill groups was longer than the model group （P<0.05）. In Y maze test， the correct number of model group was less than blank group， and increased significantly after treatment （P<0.05）. The optical density of NR2A and NR2B was lower in model group than blank group （P<0.05） and higher in Zuogui Pill and Yougui Pill groups than model group （P<0.05）. Conclusion The neurobehavioral is abnormal and NMDA receptor expression depresses in rats with kidney- deficiency constitution. Zuogui Pill and Yougui Pill can rise NMDA receptor expression and improve brain function of rats， which reveal the correlation between kidney-deficiency constitution and brain function decline， and material basis of kidney-storing-spirit theory and neurobiology mechanism. Key words：kidney-deficiency constitution；suspension test；Y maze test；NR2A；NR2B；rats
基金项目：陕西省科技厅研究项目（2013JM4033）；陕西省重点实验室研究项目（13JS031）
《灵枢·本神》曰：“恐惧而不解则伤精，精伤者则骨酸痿厥，精时自下。”王冰注释：“恐而不已则内感于肾，故伤也。”中医理论认为，肾为先天之本，藏有先天之精和后天之精，肾精的盛衰决定着子代禀赋的强弱。肾藏精生髓，脑为髓海，主神志思维，司机体运动。髓由肾精及气血所化，充养脑实质，肾虚则经不上承而脑髓空虚、脑窍失养致脑失其用[1]。本实验以肾虚质大鼠运动、学习等神经行为学改变和海马N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚基NR2A、NR2B蛋白表达为切入点，探讨肾虚质和脑功能衰退的相关性，以及肾藏志理论的物质基础和神经生物学机制。
1 实验材料
1.1 动物
8周龄清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量200～300 g，西安交通大学医学院实验动物中心，许可证号SCXK（陕）2007-001。标准饲料喂食，不限饮水，室温。雌雄土猫各1只，3月龄，凶狠善叫，鲜活大鼠喂食，不限饮水，室温。
1.2 主要药物、试剂与及仪器
左归丸（批号100306）、右归丸（批号110309），河南省宛西制药股份有限公司。DAB显色试剂盒、SABC试剂盒、枸橼酸缓冲液、水合氯醛、乙醇、多聚甲醛、30%蔗糖溶液、OCT包埋剂、30%H2O2、NR2A、NR2B一抗、二抗（武汉博士德生物技术公司）。Y迷宫（上海软隆科技发展有限公司），电子天平、冰冻切片机、显微镜等。
2 实验方法
2.1 分组与造模
参照本课题组前期研究方法[2]，大鼠适应性饲养1周，按雄性∶雌性=1∶2比例合笼交配。成功受孕后将孕母鼠随机分为对照组和肾虚组，每组10只。肾虚组孕鼠置于特制鼠笼，于8：00-19：00置于猫笼旁进行恐吓，同时在猫笼内放置雄鼠令其捕食使孕鼠在旁处于恐慌状态。对照组孕鼠不作刺激处理。非恐吓时间2组均置于同处并确保其他非处理因素一致，至2组孕鼠产子，将仔鼠饲养4周后进行分组。空白组从对照组孕鼠所产仔鼠中随机选取10只；肾虚组孕鼠所产仔鼠随机选取30只，分为模型组、左归丸组和右归丸组各10只，继续对此3组仔鼠实施上述“猫吓鼠”方案，持续个1月。空白组仔鼠零刺激，非恐吓时间4组仔鼠均置于同处减小非处理因素。
2.2 给药
大鼠用药量约为成人的6.25倍[3]。左归丸每10丸含原药材1 g，成人每日服18 g，则大鼠每日服1.875 g/kg，蒸馏水配成1.875 g/mL混悬液备用。右归丸每8丸含原药材3 g，成人每日服9 g，则大鼠每日服0.937 5 g/kg，蒸馏水配成0.937 5 g/mL混悬液备用。对仔鼠恐吓同时开始给药，药物组分别予上述混悬液灌胃，空白组和模型组予等量生理盐水灌胃，给药体积10 mL/kg，每日1次，每周用药5 d，停2 d， 连续2个月。
2.3 神经行为学检测
2.3.1 悬吊试验 各组仔鼠8周龄时进行悬吊试验，使仔鼠前爪抓住距桌面50 cm高水平放置的玻璃棒（棒长约40 cm，直径0.6 cm），记录仔鼠掉至桌面的时间，计分评判仔鼠运动能力。评分标准：<10 s计1分，10～30 s计2分，>30～120 s计3分，>2～5 min计4分，>5 min计5分。每只仔鼠悬吊3次，每次休息10 min，取3次平均值。
2.3.2 Y迷宫实验 各组仔鼠10周龄时进行Y迷宫实验，Y迷宫三条臂尽头均有一盏15 W灯泡，底部为电网，电压50～70 V。实验时一条臂灯亮，底部电网不通电为安全区；另两侧灯不亮，延时5 s后底部通电为非安全区，刺激仔鼠使其跑向安全区。仔鼠到达安全区30 s后随机更换安全区位置，10 s内顺利从非安全区一次性跑到安全区则判为正确。每只仔鼠实验后75%酒精擦洗Y臂以排除气味干扰。实验第1日为适应阶段，每只仔鼠在Y迷宫中自由活动5 min；第2～4日为学习训练阶段，每只仔鼠从同一臂即起始臂放入Y迷宫，30次/d，持续训练3 d；第5日为测试阶段，记录30次测试中仔鼠正确进入安全区的次数。
2.4 NR2A、NR2B蛋白表達检测
2.4.1 组织提取及切片 各组仔鼠用药2个月、禁食12 h后称重，7%水合氯醛0.05 mL/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，取海马4%多聚甲醛4 ℃固定4～6 h，PBS冲洗5 min×3次，置30%蔗糖4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次、干燥、OCT包埋，冰冻切片，室温静置1 h待测。
2.4.2 免疫组化法检测 切片置于甲醇新鲜配制的0.3%双氧水，室温封闭20 min，消除内源性过氧化物酶，PBS洗5 min×3次，置于0.01 mol/L pH 6.0枸橼酸缓冲液95 ℃，煮沸15 min，冷却后PBS洗5 min×3次，5%BSA 37 ℃封闭20 min，弃多余液体；滴加稀释后一抗，4 ℃过夜，取出复温，PBS洗5 min×3次，滴加二抗， 37 ℃温浴30 min，PBS洗5 min×3次，，滴加新鲜配制的DAB显色液避光显色，镜下控制显色程度，双蒸水洗终止显色，苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37 ℃干燥过夜，光镜下观察拍照，应用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，对阳性细胞测定平均吸光度值。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果 4.1 神经行为学检测结果
4.1.1 悬吊试验 模型组悬吊持续时间明显低于空白组（P<0.05），左归丸组和右归丸组持续时间明显高于模型组（P<0.05），见表1。
4.1.2 Y迷宫实验 模型组进入安全正确次数明显低于空白组（P<0.05），左归丸组和右归丸组正确次数明显高于模型组（P<0.05），见表2。
4.2 补肾中药对NR2A、NR2B蛋白表达的影响
与空白组比较，模型组NR2A、NR2B平均吸光度值明显降低（P<0.05）；与模型组比较，左归丸组和右归丸组平均吸光度值明显升高（P<0.05）。镜下观察显示，空白组神经细胞较多，细胞结构致密且层次清楚；模型组脑组织存在散在的片状水肿，神经细胞数目减少、细胞结构松散；左归丸组和右归丸组大脑皮质海马区神经细胞较多，细胞结构致密且层次清楚，无明显水肿区。结果见表3、图1、图2。
5 讨论
肾虚质是各类人群中常见的体质类型之一，是一种以肾中精气亏虚、肾脏功能低下为主要特征的体质状态[4]。中医情志学说有“肾藏志，在志为恐”，一方面，“脑为元神之府”，是“肾藏志”理论中“志”产生活动的中枢部位；另一方面，“脑为髓之海”，肾虚则髓不实，肾虚以“髓”为中介反作用于脑，直接影响机体运动与思维。
临床研究表明，肾虚质多包含脑神经行为方面的障碍[5-7]。悬吊试验是随意运动检测，主要反映肌力、躯体平衡力及上肢运动力。实验中模型组仔鼠运动力低于空白组，通过补肾药物治疗后结果逆转。Y迷宫实验主要应用于动物的辨别性学习、工作记忆及参考记忆的测试，因其受实验环境、温度和操作等影响较小而广泛应用于学习和记忆研究领域[8]。Y迷宫实验中，模型组较空白组正确次数降低，表明肾虚对运动功能和
空间学习记忆力的抑制作用及补肾药物的治疗作用。
研究表明，NMDA受体与突触传递长时程增强、突触可塑性、学习记忆、神经系统生长发育的可塑性、缺血缺氧损伤、中枢神经系统内的疼痛传导、术后认知功能障碍及老年性痴呆等神经退行性疾病等都有密切关系[9]。NR2A与NR2B是NMDA受体的2个重要亚基，在皮层特征性发育转变中具有重要作用，且主要与学习记忆的获得关系密切[10-11]。所以，本实验选取NR2A、NR2B的表达为切入点，从神经生物学角度揭示肾虚质对脑学习记忆能力的抑制性影响。实验结果显示，肾虚质组NR2A与NR2B的低表达及补肾药物干预后的表达回升均反映出与前期研究结果一致，即肾虚质抑制性影响脑功能。
肾虚体质主要表现为肾精亏虚，肾藏精是肾的最基本功能，肾精所产生的生理效应有肾阴、肾阳两大方面，故实验中设立了补肾阴的左归丸组和补肾阳的右归丸进行观察。作为补肾中药的代表方，左归丸、右归丸可影响老年大鼠大脑边缘系统（海马、杏仁核）对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺（HPAT）軸的调控作用，可纠正老年大鼠神经内分泌功能的异常变化[12]，并且可以通过提高脑源性神经营养因子及其受体TrkB的基因表达改善老年大鼠的学习记忆能力[13]。实验结果显示，给予左归丸、右归丸治疗后，仔鼠运动能力、空间学习记忆能力及NMDA受体亚基表达均有所提高，说明本研究所建立的肾虚体质动物模型主要表现为肾精虚，精虚不能舍志从而导致大脑功能减退。提示补肾中药可用来治疗有肾虚质特征的脑功能障碍，同时提示NMDA受体是肾藏志理论中重要的物质基础，揭示了肾藏志理论的神经生物学机制。
参考文献：
[1] 牛磊.论肾虚与帕金森病的关系[J].中国中医药信息杂志，2011， 11（18）：99-100.
[2] 孙理军，李翠娟，王震，等.肾虚质实验动物模型的构建方法与评价[J].时珍国医国药，2013，24（1）：247-249.
[3] 何诚.实验动物学[M].北京：中国农业大学出版社，2006：283.
[4] 孙理军，李翠娟，王震，等.关于肾虚质实验动物模型相关问题的研究与思考[J].时珍国医国药，2012，23（12）：3094-3095.
[5] MacDonald JF， Jackson MF， Beazely MA. Hippocampal long-term synaptic plasticity and signal amplification of NMDA receptors[J]. Crit Rev Neurobiol，2006，18（1/2）：71-84.
[6] Yamin G. NMDA receptor-dependent signaling pathways that underlie amyloid beta-protein disruption of LTP in the hippocampus[J]. J Neurosci Res，2009，87（8）：1729-1736.
[7] Kullmann DM， Lamsa K. Roles of distinct glutamate receptors in induction of anti-Hebbian long-term potentiation[J]. J Physiol， 2008，586（6）：1481-1486.
[8] Stout JC， Weiss JM. An animal model for measuring behavioral responses to anxiogenic and anxiolytic manipulations[J]. Pharmacol Biochem Behav，1994，47（3）：459-465.
[9] 唐启盛，包祖晓，曲淼，等.肾与神志关系的探讨[J].北京中医，2006， 25（9）：538-540.
[10] White TL， Youngentob SL. The effect of NMDA-NR2B receptor subunit over-expression on olfactory memory task performance in the mouse[J]. Brain Research，2004，1021（1）：1-7.
[11] Mathur P， Graybeal C， Feyder M， et al. Fear memory impairing effects of systemic treatment with the NMDA NR2B subunit antagonist， Ro 25-6981， in mice：Attenuation with ageing[J]. Pharmacol Biochem Behav，2009，91（3）：453-460.
[12] 戴薇薇，金国琴，张学礼，等.左归丸、右归丸对老年大鼠海马、杏仁核氨基酸类神经递质含量变化的影响[J].中华中医药杂志，2005，20（7）：397-400.
[13] 戴薇薇，金国琴，张学礼，等.左归丸、右归丸对衰老大鼠海马学习记忆相关基因BDNF mRNA表达的影响[J].中药药理与临床，2007，23（4）：14-16.
（收稿日期：2015-01-05）
（修回日期：2015-01-28；编辑：华强）
关键词：肾虚质；悬吊试验；Y迷宫实验；NR2A蛋白；NR2B蛋白；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0052-04
Study on Neurobehavioral Disorders and NMDA Receptor Expression in Rats with Kidney-deficiency Constitution SUN Yu-ru， SUN Yao-guang， ZHANG Qi， WANG Xiao-di， WANG Xing， SUN Li-jun （Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）
Abstract：Objective To discuss the correlation between kidney-deficiency constitution and brain function decline， and material basis of kidney-storing-spirit theory and neurobiology mechanism. Methods By employing the method of “cats scare rats”， composite offspring rat models with deficiency and acquired dystrophy were built， then they were divided into model group， Zuogui Pill group and Yougui Pill group. Blank group was composed from normal pregnant rats. When the intimidation of offspring began， Zuogui Pill and Yougui Pill groups received gavage with corresponding doses of medicine， 1 times per day for 2 consecutive months. Model and blank groups received the same amount of normal saline. Exercise capacity was detected by suspension test. Learning and memory capacity was detected by Y maze test. Expressions of NMDA receptor subunits NR2A and NR2B were detected by immunohistochemical method. Results In suspension test， the duration of model group was shorter than blank group （P<0.05）， while duration of Zuogui Pill and Yougui Pill groups was longer than the model group （P<0.05）. In Y maze test， the correct number of model group was less than blank group， and increased significantly after treatment （P<0.05）. The optical density of NR2A and NR2B was lower in model group than blank group （P<0.05） and higher in Zuogui Pill and Yougui Pill groups than model group （P<0.05）. Conclusion The neurobehavioral is abnormal and NMDA receptor expression depresses in rats with kidney- deficiency constitution. Zuogui Pill and Yougui Pill can rise NMDA receptor expression and improve brain function of rats， which reveal the correlation between kidney-deficiency constitution and brain function decline， and material basis of kidney-storing-spirit theory and neurobiology mechanism. Key words：kidney-deficiency constitution；suspension test；Y maze test；NR2A；NR2B；rats
基金项目：陕西省科技厅研究项目（2013JM4033）；陕西省重点实验室研究项目（13JS031）
《灵枢·本神》曰：“恐惧而不解则伤精，精伤者则骨酸痿厥，精时自下。”王冰注释：“恐而不已则内感于肾，故伤也。”中医理论认为，肾为先天之本，藏有先天之精和后天之精，肾精的盛衰决定着子代禀赋的强弱。肾藏精生髓，脑为髓海，主神志思维，司机体运动。髓由肾精及气血所化，充养脑实质，肾虚则经不上承而脑髓空虚、脑窍失养致脑失其用[1]。本实验以肾虚质大鼠运动、学习等神经行为学改变和海马N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚基NR2A、NR2B蛋白表达为切入点，探讨肾虚质和脑功能衰退的相关性，以及肾藏志理论的物质基础和神经生物学机制。
1 实验材料
1.1 动物
8周龄清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量200～300 g，西安交通大学医学院实验动物中心，许可证号SCXK（陕）2007-001。标准饲料喂食，不限饮水，室温。雌雄土猫各1只，3月龄，凶狠善叫，鲜活大鼠喂食，不限饮水，室温。
1.2 主要药物、试剂与及仪器
左归丸（批号100306）、右归丸（批号110309），河南省宛西制药股份有限公司。DAB显色试剂盒、SABC试剂盒、枸橼酸缓冲液、水合氯醛、乙醇、多聚甲醛、30%蔗糖溶液、OCT包埋剂、30%H2O2、NR2A、NR2B一抗、二抗（武汉博士德生物技术公司）。Y迷宫（上海软隆科技发展有限公司），电子天平、冰冻切片机、显微镜等。
2 实验方法
2.1 分组与造模
参照本课题组前期研究方法[2]，大鼠适应性饲养1周，按雄性∶雌性=1∶2比例合笼交配。成功受孕后将孕母鼠随机分为对照组和肾虚组，每组10只。肾虚组孕鼠置于特制鼠笼，于8：00-19：00置于猫笼旁进行恐吓，同时在猫笼内放置雄鼠令其捕食使孕鼠在旁处于恐慌状态。对照组孕鼠不作刺激处理。非恐吓时间2组均置于同处并确保其他非处理因素一致，至2组孕鼠产子，将仔鼠饲养4周后进行分组。空白组从对照组孕鼠所产仔鼠中随机选取10只；肾虚组孕鼠所产仔鼠随机选取30只，分为模型组、左归丸组和右归丸组各10只，继续对此3组仔鼠实施上述“猫吓鼠”方案，持续个1月。空白组仔鼠零刺激，非恐吓时间4组仔鼠均置于同处减小非处理因素。
2.2 给药
大鼠用药量约为成人的6.25倍[3]。左归丸每10丸含原药材1 g，成人每日服18 g，则大鼠每日服1.875 g/kg，蒸馏水配成1.875 g/mL混悬液备用。右归丸每8丸含原药材3 g，成人每日服9 g，则大鼠每日服0.937 5 g/kg，蒸馏水配成0.937 5 g/mL混悬液备用。对仔鼠恐吓同时开始给药，药物组分别予上述混悬液灌胃，空白组和模型组予等量生理盐水灌胃，给药体积10 mL/kg，每日1次，每周用药5 d，停2 d， 连续2个月。
2.3 神经行为学检测
2.3.1 悬吊试验 各组仔鼠8周龄时进行悬吊试验，使仔鼠前爪抓住距桌面50 cm高水平放置的玻璃棒（棒长约40 cm，直径0.6 cm），记录仔鼠掉至桌面的时间，计分评判仔鼠运动能力。评分标准：<10 s计1分，10～30 s计2分，>30～120 s计3分，>2～5 min计4分，>5 min计5分。每只仔鼠悬吊3次，每次休息10 min，取3次平均值。
2.3.2 Y迷宫实验 各组仔鼠10周龄时进行Y迷宫实验，Y迷宫三条臂尽头均有一盏15 W灯泡，底部为电网，电压50～70 V。实验时一条臂灯亮，底部电网不通电为安全区；另两侧灯不亮，延时5 s后底部通电为非安全区，刺激仔鼠使其跑向安全区。仔鼠到达安全区30 s后随机更换安全区位置，10 s内顺利从非安全区一次性跑到安全区则判为正确。每只仔鼠实验后75%酒精擦洗Y臂以排除气味干扰。实验第1日为适应阶段，每只仔鼠在Y迷宫中自由活动5 min；第2～4日为学习训练阶段，每只仔鼠从同一臂即起始臂放入Y迷宫，30次/d，持续训练3 d；第5日为测试阶段，记录30次测试中仔鼠正确进入安全区的次数。
2.4 NR2A、NR2B蛋白表達检测
2.4.1 组织提取及切片 各组仔鼠用药2个月、禁食12 h后称重，7%水合氯醛0.05 mL/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，取海马4%多聚甲醛4 ℃固定4～6 h，PBS冲洗5 min×3次，置30%蔗糖4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次、干燥、OCT包埋，冰冻切片，室温静置1 h待测。
2.4.2 免疫组化法检测 切片置于甲醇新鲜配制的0.3%双氧水，室温封闭20 min，消除内源性过氧化物酶，PBS洗5 min×3次，置于0.01 mol/L pH 6.0枸橼酸缓冲液95 ℃，煮沸15 min，冷却后PBS洗5 min×3次，5%BSA 37 ℃封闭20 min，弃多余液体；滴加稀释后一抗，4 ℃过夜，取出复温，PBS洗5 min×3次，滴加二抗， 37 ℃温浴30 min，PBS洗5 min×3次，，滴加新鲜配制的DAB显色液避光显色，镜下控制显色程度，双蒸水洗终止显色，苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37 ℃干燥过夜，光镜下观察拍照，应用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，对阳性细胞测定平均吸光度值。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果 4.1 神经行为学检测结果
4.1.1 悬吊试验 模型组悬吊持续时间明显低于空白组（P<0.05），左归丸组和右归丸组持续时间明显高于模型组（P<0.05），见表1。
4.1.2 Y迷宫实验 模型组进入安全正确次数明显低于空白组（P<0.05），左归丸组和右归丸组正确次数明显高于模型组（P<0.05），见表2。
4.2 补肾中药对NR2A、NR2B蛋白表达的影响
与空白组比较，模型组NR2A、NR2B平均吸光度值明显降低（P<0.05）；与模型组比较，左归丸组和右归丸组平均吸光度值明显升高（P<0.05）。镜下观察显示，空白组神经细胞较多，细胞结构致密且层次清楚；模型组脑组织存在散在的片状水肿，神经细胞数目减少、细胞结构松散；左归丸组和右归丸组大脑皮质海马区神经细胞较多，细胞结构致密且层次清楚，无明显水肿区。结果见表3、图1、图2。
5 讨论
肾虚质是各类人群中常见的体质类型之一，是一种以肾中精气亏虚、肾脏功能低下为主要特征的体质状态[4]。中医情志学说有“肾藏志，在志为恐”，一方面，“脑为元神之府”，是“肾藏志”理论中“志”产生活动的中枢部位；另一方面，“脑为髓之海”，肾虚则髓不实，肾虚以“髓”为中介反作用于脑，直接影响机体运动与思维。
临床研究表明，肾虚质多包含脑神经行为方面的障碍[5-7]。悬吊试验是随意运动检测，主要反映肌力、躯体平衡力及上肢运动力。实验中模型组仔鼠运动力低于空白组，通过补肾药物治疗后结果逆转。Y迷宫实验主要应用于动物的辨别性学习、工作记忆及参考记忆的测试，因其受实验环境、温度和操作等影响较小而广泛应用于学习和记忆研究领域[8]。Y迷宫实验中，模型组较空白组正确次数降低，表明肾虚对运动功能和
空间学习记忆力的抑制作用及补肾药物的治疗作用。
研究表明，NMDA受体与突触传递长时程增强、突触可塑性、学习记忆、神经系统生长发育的可塑性、缺血缺氧损伤、中枢神经系统内的疼痛传导、术后认知功能障碍及老年性痴呆等神经退行性疾病等都有密切关系[9]。NR2A与NR2B是NMDA受体的2个重要亚基，在皮层特征性发育转变中具有重要作用，且主要与学习记忆的获得关系密切[10-11]。所以，本实验选取NR2A、NR2B的表达为切入点，从神经生物学角度揭示肾虚质对脑学习记忆能力的抑制性影响。实验结果显示，肾虚质组NR2A与NR2B的低表达及补肾药物干预后的表达回升均反映出与前期研究结果一致，即肾虚质抑制性影响脑功能。
肾虚体质主要表现为肾精亏虚，肾藏精是肾的最基本功能，肾精所产生的生理效应有肾阴、肾阳两大方面，故实验中设立了补肾阴的左归丸组和补肾阳的右归丸进行观察。作为补肾中药的代表方，左归丸、右归丸可影响老年大鼠大脑边缘系统（海马、杏仁核）对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺（HPAT）軸的调控作用，可纠正老年大鼠神经内分泌功能的异常变化[12]，并且可以通过提高脑源性神经营养因子及其受体TrkB的基因表达改善老年大鼠的学习记忆能力[13]。实验结果显示，给予左归丸、右归丸治疗后，仔鼠运动能力、空间学习记忆能力及NMDA受体亚基表达均有所提高，说明本研究所建立的肾虚体质动物模型主要表现为肾精虚，精虚不能舍志从而导致大脑功能减退。提示补肾中药可用来治疗有肾虚质特征的脑功能障碍，同时提示NMDA受体是肾藏志理论中重要的物质基础，揭示了肾藏志理论的神经生物学机制。
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（收稿日期：2015-01-05）
（修回日期：2015-01-28；编辑：华强）