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摘要：对水产品中喹乙醇高效液相色谱-紫外法检测过程中加标回收率偏低问题进行了分析，找出实验过程中影响喹乙醇回收率偏低的原因。通过增加无水硫酸钠及定容液的添加量，延长对旋蒸瓶的震荡时间，降低影响因素对实验结果的影响，并進行讨论，方法回收率71%～79%之间，实验结果满足分析实验的要求。
关键词：高效液相色谱-紫外法；水产品；喹乙醇
喹乙醇（Olaquindox），又称喹酰胺醇，商品名称为快育灵、倍育诺，具有良好的广谱抗菌效果和促生长作用，以前被广泛用于兽药及水产品饲料添加剂中。但由于喹乙醇有中度至明显的蓄积毒性，其通过食物链进人人体后对人有潜在的致畸形、致突变、致癌作用，《中国兽药典》（2005版）明确规定喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖中。
随着养殖业的高速发展及集约化养殖模式下的不规范运作，导致病害问题日趋严重，加之当今零星的和不完整的疾病知识与技术，疾病一旦发生，滥用抗生素和化学药物时有发生，水产品违禁药物的使用仍屡禁不止，水产品中喹乙醇超标问题屡有报道，为保障食品安全和广大人民群众的身体健康，从源头上对水产品安全进行把控，对水产品中喹乙醇的检测刻不容缓。水产品中喹乙醇检测过程中，由于水产品复杂的成分及喹乙醇自身性质等原因，造成一般常用的高效液相色谱一紫外法检测过程中加标回收率偏低，本文针对造成回收率偏低的影响因素进行讨论并消除，尽可能减少实验的误差，使检测结果准确可靠。
1材料与方法
1.1材料
喹乙醇标准品（Dr.Ehrenstorfer 99.0%），甲醇、乙腈为上海安谱色谱纯，实验样品为大菱鲆、海参及中国对虾等多种水产品。
1.2仪器与设备
Agilentl200高效液相色谱仪：紫外检测器，高速冷冻离心机（STl6R），美国热电公司；超声波清洗器；氮吹仪；旋转蒸发仪。
1.3色谱分析条件
1.3.1分析条件 XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5um），检测器波长380 nm，进样量20gL，柱温35℃，流动相为甲醇-水（15+85）溶液，流量1.0 mL/min。
1.3.2喹乙醇的提取 称取5.00 g样品置于50mL离心管中，加入无水硫酸钠10 g搅匀，再加入乙腈30 mL，涡旋混合2 min，于振荡器上振荡提取15 min，以4 000 r/min转速离心10 min，将上清液倒入125 mL棕色旋转蒸发瓶中，再向离心管中加入乙腈20 mL，重复操作一次，合并上清液。
1.3.3喹乙醇去脂 在40℃水浴下旋转减压蒸馏至近干，向棕色旋蒸瓶中加入流动相2.00 mL和正己烷（用乙腈饱和）5 mL，充分洗涤溶解残留物后，倒人10 mL离心管中，以4 000 r/min转速离心10 min，下层液体经O.45um微孑L滤膜过滤后进行测定。
2结果与分析
2.1水产品中喹乙醇测定过程中回收率低的影响因素及消除
喹乙醇测定过程中，由于喹乙醇见光分解速度很快，谢小华等证实在直射光条件下，白色瓶中喹乙醇0.75 h后完全被分解，低于仪器的检出限。实验过程中应注意避光，尽量在光线较暗的环境下操作，液相进样小瓶用棕色材质，样品处理完后应立即上机测试。
喹乙醇旋蒸结束后，脂肪等杂质残留于旋蒸瓶壁上，导致喹乙醇不易被流动相洗脱出来，加入正己烷和流动相后应充分混合振荡，在漩涡振荡器上振荡5 min，确保旋蒸瓶壁上全部的喹乙醇被溶解在流动相内。
实验过程中提高流动相的加入量，一方面提高喹乙醇提取率，另一方面由于流动相的比例增大，降低旋蒸不干对定量及喹乙醇液相测试出峰时间的影响，对检测结果的准确有很大意义。
2.2水产品喹乙醇测定过程中旋蒸不干的影响因素及消除
水产品含有相当比例的水分，喹乙醇提取剂为乙腈，乙腈与水互溶，样品前处理过程中混杂了水溶性蛋白，如果样品中水不完全去除，喹乙醇提取液在40℃水浴不易被浓缩蒸干，将旋蒸不干的样品加入流动相定容上机，会造成流动相被稀释和流动相量的增加，导致喹乙醇定量的不准确和出峰时间的偏移。提取过程中向样品中加入无水硫酸钠，应确保无水硫酸钠的干燥。无水硫酸钠在马弗炉中650℃烘干，置人干燥器内冷却后使用，对于含水率较大的样品适量增加无水硫酸钠的用量。
2.3水产品喹乙醇测定过程中流动相配比问题
于慧娟等证实甲醇一水分离体系优于乙腈一水，甲醇-水为分离喹乙醇的流动相。流动相中甲醇含量15%，甲醇含量越高（>30%），保留时间就越短；而甲醇含量越低（<10%），保留时间就越长，经实验确定甲醇一水的最佳配比为15：85（体积比）。在此分离条件下，喹乙醇峰形对称，柱效高，且与样品本底有良好的分离。
2.4水产品中喹乙醇测定过程中去脂不完全问题
水产品喹乙醇检测过程中，由于样品中脂肪含量比较高，易被乙腈提取出来，加入正己烷去脂过程中由于去脂不完全，容易造成有脂肪与定容液分离不完全，导致离心管中下层定容液内存在脂肪，实验过程中，对去脂不完全的样品，弃去上层已被脂肪饱和的正己烷，继续在离心管中添加正己烷，漩涡振荡，重复去脂，直至下层提取液变清，能够满足液相上机检测的要求。
2.5增加无水硫酸钠及定容液的添加量、延长鸡心瓶的震荡时间提高回收率
实验过程中，我们通过将不同品种的水产品添加标准溶液，制成不同浓度的阳性样品，分别对无水硫酸钠及定容液的添加量、鸡心瓶的震荡时间进行试验，以提高加标回收率。常规方法是无水硫酸钠的添加量为O.04 g、定容液的添加量为1 mL、鸡心瓶的振荡时间为60 s；方法改进后，无水硫酸钠的添加量增至为0.05～0.06 g、定容液的添加量增至为1.02～1.03 mL、鸡心瓶的振荡时间增至为90～100 s。
结果表明，方法改进前回收率在48%～60%（见表1），方法回收率偏低。方法改进后回收率在71%～79%（见表2）。通过实验证明改进后的实验结果能够满足分析实验对检测结果准确可靠性的判定要求。
3结论与讨论
喹乙醇净化过程中适当提高定容液的用量，旋蒸瓶需要长时间振荡，确保喹乙醇完全被定容液提取出来。
样品处理完后尽量缩短上机时间，保证样品尽快测量，降低喹乙醇的自然损失，尽量提高喹乙醇的回收率。
光照对喹乙醇检测结果影响较大，检测过程中应注意严格避光（严格避光条件下光照强度为0.11x），除了做到用棕色鸡心瓶和棕色进样小瓶，在前处理的过程中，每一步应采取避光措施。
样品脂肪含量过高，提取液出现乳化现象时，为了防止正己烷去脂肪带来的待测成分的损失，最佳方法是50～60℃水浴，重新涡旋振荡并离心。若还存在乳化现象，再采取重复加正己烷去脂的方法，并且重复1～2次即可。
关键词：高效液相色谱-紫外法；水产品；喹乙醇
喹乙醇（Olaquindox），又称喹酰胺醇，商品名称为快育灵、倍育诺，具有良好的广谱抗菌效果和促生长作用，以前被广泛用于兽药及水产品饲料添加剂中。但由于喹乙醇有中度至明显的蓄积毒性，其通过食物链进人人体后对人有潜在的致畸形、致突变、致癌作用，《中国兽药典》（2005版）明确规定喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖中。
随着养殖业的高速发展及集约化养殖模式下的不规范运作，导致病害问题日趋严重，加之当今零星的和不完整的疾病知识与技术，疾病一旦发生，滥用抗生素和化学药物时有发生，水产品违禁药物的使用仍屡禁不止，水产品中喹乙醇超标问题屡有报道，为保障食品安全和广大人民群众的身体健康，从源头上对水产品安全进行把控，对水产品中喹乙醇的检测刻不容缓。水产品中喹乙醇检测过程中，由于水产品复杂的成分及喹乙醇自身性质等原因，造成一般常用的高效液相色谱一紫外法检测过程中加标回收率偏低，本文针对造成回收率偏低的影响因素进行讨论并消除，尽可能减少实验的误差，使检测结果准确可靠。
1材料与方法
1.1材料
喹乙醇标准品（Dr.Ehrenstorfer 99.0%），甲醇、乙腈为上海安谱色谱纯，实验样品为大菱鲆、海参及中国对虾等多种水产品。
1.2仪器与设备
Agilentl200高效液相色谱仪：紫外检测器，高速冷冻离心机（STl6R），美国热电公司；超声波清洗器；氮吹仪；旋转蒸发仪。
1.3色谱分析条件
1.3.1分析条件 XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5um），检测器波长380 nm，进样量20gL，柱温35℃，流动相为甲醇-水（15+85）溶液，流量1.0 mL/min。
1.3.2喹乙醇的提取 称取5.00 g样品置于50mL离心管中，加入无水硫酸钠10 g搅匀，再加入乙腈30 mL，涡旋混合2 min，于振荡器上振荡提取15 min，以4 000 r/min转速离心10 min，将上清液倒入125 mL棕色旋转蒸发瓶中，再向离心管中加入乙腈20 mL，重复操作一次，合并上清液。
1.3.3喹乙醇去脂 在40℃水浴下旋转减压蒸馏至近干，向棕色旋蒸瓶中加入流动相2.00 mL和正己烷（用乙腈饱和）5 mL，充分洗涤溶解残留物后，倒人10 mL离心管中，以4 000 r/min转速离心10 min，下层液体经O.45um微孑L滤膜过滤后进行测定。
2结果与分析
2.1水产品中喹乙醇测定过程中回收率低的影响因素及消除
喹乙醇测定过程中，由于喹乙醇见光分解速度很快，谢小华等证实在直射光条件下，白色瓶中喹乙醇0.75 h后完全被分解，低于仪器的检出限。实验过程中应注意避光，尽量在光线较暗的环境下操作，液相进样小瓶用棕色材质，样品处理完后应立即上机测试。
喹乙醇旋蒸结束后，脂肪等杂质残留于旋蒸瓶壁上，导致喹乙醇不易被流动相洗脱出来，加入正己烷和流动相后应充分混合振荡，在漩涡振荡器上振荡5 min，确保旋蒸瓶壁上全部的喹乙醇被溶解在流动相内。
实验过程中提高流动相的加入量，一方面提高喹乙醇提取率，另一方面由于流动相的比例增大，降低旋蒸不干对定量及喹乙醇液相测试出峰时间的影响，对检测结果的准确有很大意义。
2.2水产品喹乙醇测定过程中旋蒸不干的影响因素及消除
水产品含有相当比例的水分，喹乙醇提取剂为乙腈，乙腈与水互溶，样品前处理过程中混杂了水溶性蛋白，如果样品中水不完全去除，喹乙醇提取液在40℃水浴不易被浓缩蒸干，将旋蒸不干的样品加入流动相定容上机，会造成流动相被稀释和流动相量的增加，导致喹乙醇定量的不准确和出峰时间的偏移。提取过程中向样品中加入无水硫酸钠，应确保无水硫酸钠的干燥。无水硫酸钠在马弗炉中650℃烘干，置人干燥器内冷却后使用，对于含水率较大的样品适量增加无水硫酸钠的用量。
2.3水产品喹乙醇测定过程中流动相配比问题
于慧娟等证实甲醇一水分离体系优于乙腈一水，甲醇-水为分离喹乙醇的流动相。流动相中甲醇含量15%，甲醇含量越高（>30%），保留时间就越短；而甲醇含量越低（<10%），保留时间就越长，经实验确定甲醇一水的最佳配比为15：85（体积比）。在此分离条件下，喹乙醇峰形对称，柱效高，且与样品本底有良好的分离。
2.4水产品中喹乙醇测定过程中去脂不完全问题
水产品喹乙醇检测过程中，由于样品中脂肪含量比较高，易被乙腈提取出来，加入正己烷去脂过程中由于去脂不完全，容易造成有脂肪与定容液分离不完全，导致离心管中下层定容液内存在脂肪，实验过程中，对去脂不完全的样品，弃去上层已被脂肪饱和的正己烷，继续在离心管中添加正己烷，漩涡振荡，重复去脂，直至下层提取液变清，能够满足液相上机检测的要求。
2.5增加无水硫酸钠及定容液的添加量、延长鸡心瓶的震荡时间提高回收率
实验过程中，我们通过将不同品种的水产品添加标准溶液，制成不同浓度的阳性样品，分别对无水硫酸钠及定容液的添加量、鸡心瓶的震荡时间进行试验，以提高加标回收率。常规方法是无水硫酸钠的添加量为O.04 g、定容液的添加量为1 mL、鸡心瓶的振荡时间为60 s；方法改进后，无水硫酸钠的添加量增至为0.05～0.06 g、定容液的添加量增至为1.02～1.03 mL、鸡心瓶的振荡时间增至为90～100 s。
结果表明，方法改进前回收率在48%～60%（见表1），方法回收率偏低。方法改进后回收率在71%～79%（见表2）。通过实验证明改进后的实验结果能够满足分析实验对检测结果准确可靠性的判定要求。
3结论与讨论
喹乙醇净化过程中适当提高定容液的用量，旋蒸瓶需要长时间振荡，确保喹乙醇完全被定容液提取出来。
样品处理完后尽量缩短上机时间，保证样品尽快测量，降低喹乙醇的自然损失，尽量提高喹乙醇的回收率。
光照对喹乙醇检测结果影响较大，检测过程中应注意严格避光（严格避光条件下光照强度为0.11x），除了做到用棕色鸡心瓶和棕色进样小瓶，在前处理的过程中，每一步应采取避光措施。
样品脂肪含量过高，提取液出现乳化现象时，为了防止正己烷去脂肪带来的待测成分的损失，最佳方法是50～60℃水浴，重新涡旋振荡并离心。若还存在乳化现象，再采取重复加正己烷去脂的方法，并且重复1～2次即可。