动物制品中磺胺类药物残留便捷式检测技术研究

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  摘要[目的]研究动物制品中磺胺类药物残留的便捷式检测技术。[方法]比较ELISA法、毛细管电泳法、高效液相色谱法检测动物制品中磺胺类药物的残留。[结果]利用ELISA法检测磺胺类药物残留具有操作简便、成本低廉、检测速率快、检测时间短等优点。[结论]ELISA法能更符合快速检测的要求,满足对肉制品中磺胺类药物快速检测。
  关键词动物制品;磺胺类药物残留;便捷式检测;ELISA
  中图分类号S851.34+7文献标识码
  A文章编号0517-6611(2018)08-0161-03
  Convenient Detection Technology of Sulfonamides Residues in the Foods of Animal Products
  XIE Tibo1,ZHANG Kai1,HE Fangyang2 et al(1.Guizhou Kwinbon Food Safety ScienceTechnology Co.,Ltd.,Guiyang,Guizhou 550009;2.Beijing Qinbang Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 100012)
  Abstract[Objective]To study the convenient detection technology of sulfonamides residues in the foods of animal products.[Method]To compare the technology of ELISA,capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography for detecting the sulfonamides residues in the foods of animal products.[Result]Using ELISA method to detect sulfonamides residues has advantages of easy operating, low cost, fast rate and short time.[Conclusion]ELISA can better meet the requirements of rapid detection and meet the rapid detection of sulfonamides in meat products.
  Key wordsAnimal products;Sulfonamides residues;Convenient detection;ELISA
  基金項目磺胺类、阿维菌素类药物快速检测技术开发及产业化项目;技术中心创新能力建设项目(20170002);慢抗快速检测试剂盒产业化。
  作者简介谢体波(1985—),男,贵州遵义人,工程师,硕士,从事食品安全快速检测研究。*通讯作者,从事食品安全生物技术研究。
  收稿日期2017-12-11
  磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)是一种化学合成的两性化合物,能抑制干扰大多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌[1],在医学和多种动物的感染性疾病防治中应用较为广泛,有数十种具有很好的疗效[2-4]。但其可残留于动物机体之中,人体摄入后,当其浓度超过峰值时,将对人体泌尿系统造成破坏,导致耐药菌株产生或菌失调等症状,严重时还会产生过敏及致癌性作用[5-9]。因此,如何合理又快速地检测畜禽肉质品种的磺胺类药物,保证食品安全变得尤为重要。在国际规定的畜禽类食品中总磺胺以及单个磺胺的最高残留限量为0.100 mg/kg,其中磺胺二甲基嘧啶的最高残留限量为0.025 mg/kg[10-11]。
  目前检测磺胺类兽药残留的方法有很多,如高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)、气相色谱(gas chromatography,GC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)、Barham 法等[12-17],但上述方法由于试验前处理繁琐,试验设备操作复杂,因而不适应大规模的检查和现场监控,从而影响食品安全检测速率。
  该研究中相关检测产品与上述仪器相比具有简便、快速、灵敏度高、准确等特点,能最大限度地减少工作时间和操作误差,可检测动物性食品中磺胺类药物残留量。
  1材料与方法
  1.1试验材料
  1.1.1试剂。
  乙腈、乙酸乙酯、正己烷、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸氢二钠、去离子水。
  1.1.2主要仪器。微孔板酶标仪 450 nm/630 nm,旋转蒸发仪,均质器,振荡器,涡旋仪,离心机,天平(感量0.01 g),刻度移液管,洗耳球,500 mL 容量瓶,10 mL 玻璃试管,2、50 mL 聚苯乙烯离心管,微量移液器。
  1.1.3试剂盒提供材料与试剂。
  96孔酶标板1块(包被有偶联抗原),0、1、3、9、27、81 μg/L标准品6瓶(1 mL/瓶),1 μg/mL高浓度标准液1瓶(1 mL/瓶),7 mL 抗体工作液,7 mL 底物液A液,7 mL底物液B液,12 mL酶标二抗,2倍浓缩复溶液 20 mL,20倍浓缩洗涤液40 mL,终止液7 mL。
  1.1.4
  配制溶液。
  配液1:乙腈-乙酸乙酯溶液,量取25 mL 乙腈和25 mL 乙酸乙酯加至50 mL 容量瓶中,混匀;配液2:0.18 mol/L磷酸盐缓冲溶液,
  称取23.22 g 十二水合磷酸氢二钠和3.91 g 二水合磷酸二氢钠,加入500 mL 去离子水溶解混匀;   配液3:0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液,称取25.80 g 十二水合磷酸氢二钠和4.35 g 二水合磷酸二氢钠,加入500 mL 去离子水溶解混匀;
  配液4:复溶工作液,
  用去离子水将浓缩复溶液按1∶1体积稀释,用于样本复溶;配液5: 洗涤液,用去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释(1 mL 20倍浓缩洗涤液+19 mL去离子水),用于酶标板的洗涤。
  1.2检测方法
  1.2.1原理。该研究采用间接竞争ELISA方法,在酶标板微孔条上预包被偶联抗原,让原有样本中所残留的磺胺类药物与酶标板微孔条上预包装偶联抗原竞争抗磺胺类药物的抗体,加入酶标二抗后,用TMB底物使其显色,样本吸光度值与其所含残留物磺胺类药物的含量呈负相关,与标准曲线相比,再乘以其对应的稀释倍数,就可以得出磺胺类药物的残留量。
  1.2.2组织样本前处理。
  ①称取1 g均质后的鸡肉或猪肉组织样本到50 mL 聚苯乙烯离心管中,加入0.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液,用涡旋仪涡动样本成糊状,加入7 mL 乙腈-乙酸乙酯溶液,振荡均匀。当样本组织溶液超过3 kg时,应保持20~25 ℃离心5 min。②移取2 mL 上层有机液至10 mL洁净干燥玻璃试管中,于50~60 ℃ 水浴氮气流下吹干。
  ③加入0.5 mL 正己烷,用涡旋仪涡动30 s溶解干燥的残留物,再加入0.5 mL 复溶工作液,用涡旋仪涡动30 s,混匀,转入2 mL 聚苯乙烯离心管中。④除去上层有机相,取下层水相25 μL 用于分析。
  1.2.3操作步骤。
  ①将所需试剂从冷藏环境中取出,使其回温至室温(20~25 ℃),每种试剂在使用之前都要摇匀。
  ②取出微孔板,将猪肉或鸡肉样本和标准品按对应微孔序列排序,并记录标准孔和样本孔所在的位置。
  ③加标准品和样本25 μL到编号所相对的微孔中,然后加入25 μL/孔抗体工作液,轻轻摇晃混合,盖上膜盖板后置25 ℃,在避光环境中反应30 min。
  ④将孔内的液体甩干,加入洗涤工作液200 μL/孔,反复洗涤3~4次,每次间隔8 s,用吸水纸拍干。
  ⑤加入酶标二抗50 μL/孔,轻轻振荡混合,在25 ℃避光环境中反应30 min,然后重复步骤④。
  ⑥加入底物液A液25 μL/孔,再加入底物液B液25 μL/孔,轻轻振荡混合,盖膜盖板后置25 ℃避光环境反应15 min,最终使其有显色反应。⑦加入终止液25 μL/孔,轻轻混匀,设定酶标仪于630 nm处,测定每孔OD值。
  1.2.4试剂盒其余指标检测方法。
  依次对试剂盒的标准性、特异性、灵敏度、精密度进行研究,并将其中的灵敏度、准确度和精密度与高效液相色谱检测的相关数据标准性进行对比。
  1.2.5磺胺类药物残留定量分析。
  样本或标准品吸光率百分比等于样本或标准品吸光度值的平均值除以第1个标准品吸光度值的平均值,再乘以100%,即
  百分吸光率=B/B0×100%
  式中,B为标准品或样本溶液的平均吸光度值;B0为0 μg/L标准溶液的平均吸光度值。
  由于标准品吸光率的变化,以标准品的吸光度值为纵坐标,磺胺类药物标准品对数为横坐标,绘制标准曲线图,带入百分比吸光率,从标准曲线上得出样本对应的浓度值,再乘以样本稀释的倍数,即为磺胺类药物的真实浓度。其中组织样本稀释1倍,畜禽肉样本稀释倍数为4倍。
  1.2.6试剂准确度和精密度的测定。准确度是指测定值与实际值间的符合程度,通常用回收率表示。精密度是反映检测方法对某一固定样品多次测定所得的重复程度,又称为重复性,这也是评定化学发光试剂盒质量的基本参数。在此次测定范围中,就通过测定样品中的相应参数来判断该试剂盒与其他检测手段的区别。
  1.2.7研究其他药物的交叉反应率。
  交叉反应率是指不同结构的抗原定性簇与抗体结合的能力。选择磺胺甲基異噁唑作为相应标准,按上述操作步骤,加入不同类的磺胺类竞争物,以试验所得化学发光强度值,计算抑制百分比,制作相应的百分曲线,通过抑制浓度,计算竞争物的交叉反应率。
  1.3注意事项
  ①当室温低于20 ℃或试剂及样本未回到室温,可能导致所有标准品的吸光度值偏低。
  ②此次使用的终止液为2 mol/L硫酸,操作时禁止与皮肤接触。
  ③在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会导致标准曲线不呈线性、重复性不好,所以将洗板抖干后应立即进行下一步操作。
  ④当加入底物液A液和B液时,显色时间通常为12~15 min。⑤每加1种试剂前需要将其摇匀。⑥该试剂应储存在2~8 ℃ 环境中,禁止冷冻并避免直接暴露在光线下。⑦发色试剂有任何颜色变化表示其已变质,应当弃之。
  2结果与分析
  2.1反应时间优化
  使用上述方法加入与之对应的标准品和抗体,室温下反应4、8、12、16 min后加入发光溶液,最终结果表明反应时间为12 min时,发光值最大(图1)。
  2.2标准曲线
  以磺胺甲基异噁唑标准品浓度对数为横坐标,百分发光率为纵坐标,绘制抑制标准曲线(图2)。
  从图2得到曲线线性方程y=-16.748x+85.442,R2=0.985 6,其中y为百分发光率,x为标准品浓度(C)对数。运用专业分析软件替换相应横坐标,所得标准工作曲线见图3,根据图3相应数据得出试剂盒在1.0~81.0 ng/mL线性范围内关系良好。
  对空白猪肉做20次试验,采用试验结果平均值加上3倍标准差的方法检测出最低检出限,根据公式计算出该试剂盒猪肉最低检出限为0.93 μg/kg。
  2.3试剂特异性的确定
  选择5种磺胺类药物(磺胺甲基异噁唑、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑),计算出交叉反应率,结果表明交叉反应率都较高,所以该试剂盒适用于检测以上5种药物,并能更好地表示所检测数据的特异性。
  2.4准确度与精密度的测定
  ELISA法、毛细管电泳法、高效液相色谱法[20]通常以回收率表示准确度,以变异系数表示精密度。从表2~4可以看出,取空白猪肉样本,分别添加磺胺甲基异噁唑标准品
  磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑至1、2 μg/kg,比较各个方法之间的差别。
  3结论
  我国对磺胺类药物在动物制品中的残留限量有着明确规定,然而在检测中大部分操作方法都面临耗时长、成本高等问题。该研究对快速检测磺胺类药物残留的3种方法进行对比,验证ELISA法、毛细管电泳法、高效液相色谱法对检测磺胺类药物准确度与灵敏度之间的差异。在研究中发现ELISA法对磺胺类药物抑制标准曲线线性良好,在试验过程中5种磺胺类药物交叉反应率高,且试剂标准曲线范围广,最低检测限为0.93 μg/kg,ELISA试剂盒法添加回收率为90.7%~101.0%,变异系数为0.4%~5.9%;毛细管电泳法添加回收率为84.2%~102.0%,变异系数为0.8%~7.2%;高效液相色谱法添加回收率为83.0%~97.3%,变异系数为3.4%~10.8%。由此可以看出,ELISA试剂盒法的准确度与精密度均高于毛细管电泳法和高效液相色谱法。该方法不仅满足国家规定的各项检测指标,而且与毛细管电泳法、高效液相色谱法相比时间缩短,符合分析周期短,样品前处理简单、迅速、灵敏的检测要求。可见用ELISA法以及提供的试剂更符合快速检测的要求,能满足对肉制品中磺胺类药物快速检测。
  参考文献
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  陈炳卿,孙长颢.食品污染与健康[M].北京:化学工业出版社,2002.
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