论文部分内容阅读
摘要：高效液相色谱（HPLC）法在样本物质含量的检测中应用广泛，但是这一技术无法检测对荧光和紫外没有信号的物质。衍生化将样本中的待分析物转化成合适的物质形式以方便HPLC检测，成为HPLC检测的重要弥补手段。本文对当前衍生化HPLC法测定药物有效成分的应用现状作一综述。
关键词：高效液相色谱法;药物;有效成分
药物中的有效成分含量多少以及有效成分种类在评估药物质量与真伪中非常重要，鉴定、检测药物中的有效成分在药品质量控制中应用广泛。高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）法是药品有效成分分离与分析的常用方法，但是仪器的荧光、紫外检测器对药物中的醇类、氨基酸类、羧酸类以及脂肪酸类有效成分检测效果并不理想。衍生化技术将药品中的成分衍生化为合适的成分来进行检测，这使得HPLC的检测范围得到了扩大，也提高了检测灵敏度。
1、衍生化HPLC
衍生化（derivatization）技术采用试剂将样本中的待分析物转化为更适合的物质形式，从而为检测提供方法。衍生化技术能够消除基质的干扰，增强离子化效率或者改变分析物的理化性质，能够提高物质的分离程度，使得目标选择性与检测仪器的灵敏度得到提高[1]。衍生化HPLC在生物、环境、食品以及医药等各个领域的痕量分析物检测中均应用广泛。
从衍生有没有与HPLC联机的角度划分，可以将化学衍生法分为离线与在线两种;根据衍生化反应的发生部位来划分，可以将其划分为柱前、柱中以及柱后衍生化法。在线柱中衍生化法在手性药物分离对映体中应用广泛，其根据药物与衍生化试剂对映体的反应来形成非对映体的产物;衍生化法改变药物成分的官能团，从而使其具有理想的荧光检测信号与紫外检测信号，提高检测灵敏度与检测范围。上述两种原理不同，因此文章中仅对当前应用广泛的在线柱后衍生化法与柱前衍生化进行讨论。
2、常用衍生化HPLC法的应用现状
2.1 柱前衍生化法
柱前衍生化反应容易操作，可以采用手工离线的方法实现样品的纯化与反应，对容积、混合试剂的要求不高，对试剂用量、反应条件以及反应时间等都要求不高。该方法能提高检测的灵敏度，还有助于提高色譜分辨率与分离方法的选择性。
对氨基酸类药物进行测定时，2，4-二硝基氟苯是最常用的试剂。醇类是表面活性剂的关键原料之一，特别是脂肪醇乙氧基化合物在化妆品行业与药物中都应用广泛，其对环境具有一定污染性。对醇类化合物的测定方法进行优化，其应用价值较高。陈哲等[2]建立柱前衍生反相HPLC对珐菲亚中的14种氨基酸进行同时测定，衍生化试剂为异硫氰酸苯酯，建立了14种氨基酸同时测定的方法。李滋等[3]采用苯甲醛作为衍生化试剂，对异烟肼注射液中游离胫的含量进行检测，发现游离胫检出限为0.5g/ml，为异烟肼注射液质控提供了检测方法。
2.2 柱后衍生化法
这一反应在检测器与色谱柱之间的反应器完成，其属于在线衍生化方法。就反应器方面，由不锈钢、聚四氟乙烯、玻璃等制成的管状反应器是最为简单的反应器，可以应用于滞留时间不超过30s的快速反应。例如将邻苯二甲醛（OPA）作为柱后衍生试剂，与氨基酸发生反应，能够尽可能避免柱前手动衍生物可能存在的不稳定因素，该方法的灵敏度与分辨率均较高。柱床反应器适用于1-5min滞留时间的中等速度的反应，其在反应器内填充固定化酶制成稳定的柱床，通入底物溶液，流动相经过玻珠时与玻珠上的衍生化反应物发生反应，根据一定流速来收集转化液。载流式反应器适用于滞留时间在5min以上的反应，其盘管细长，出于减少峰扩张的目的，试剂与洗脱液混合的过程中要将空气不断打入，或者打入不溶于流动相的容积，从而促使溶液在分割的情况下流动，这一方法可维持峰扩张不超过10%。除此之外，光化学检测反应器适用于一些仅需光照即可完成结构变化的反应物。
就柱后衍生化的试剂选择方面，OPA是氨基酸、胺的柱后衍生化试剂，其与氨基酸发生反应，生成荧光衍生物，其具有快速、灵敏的特点，检测效果良好，是柱后衍生化的常用试剂。张杨慧等[4]应用OPA进行柱后衍生化，建立了硫酸卡那霉素注射液及滴眼液含量的检测方法，发现卡那霉素在0.0973-583.8g/ml浓度范围内的线性关系良好（r=0.9999）。苏小洁[5]采用浓度0.05%的碘溶液作为衍生试剂，采用免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱荧光法检测山楂黄曲霉素B1、B2、G1、G2含量，发现其最低检出限分别为0.6pg、0.1pg、0.7pg、0.2pg。
3、结论
衍生法HPLC以柱前衍生化法与柱后衍生化法比较常用。前者优点众多，但是部分衍生化后的部分化合物反应产物种类较多，这使得样品组分有时候会出现多个色谱峰而使得色谱图变得非常复杂，因此柱前衍生化法的应用有一定限制。柱后衍生化法在经过色谱柱分离后、进入检测器前进行，因此这一方法可以连续、自动地进行，具有容易操作的优势。由于该方法在分离后完成衍生化，这使得色谱分离能将样品自身的性质反应出来。柱后衍生化法也存在一定限制，例如要求衍生化反应具有良好重现性，要求控制反应时间，还要求过量衍生试剂与反应后生成的副产物不能对检测造成影响，受到这些限制，柱后衍生化法的应用还并不广泛。但是总的来说，衍生化法HPLC的发展前景广阔。
参考文献
[1]何继杰，张晓凤，钱莉莉，等.痕量氨基酸分析方法研究进展[J].分析科学学报，2019，35（04）：507-513.
[2]陈哲，路娟，彭纪铭，等.柱前衍生RP-HPLC法同时测定珐菲亚中14种水解氨基酸[J].药学实践杂志，2017，35（02）：130-133.
[3]李滋，于润芳，侯宁，等.柱前衍生化HPLC法测定异烟肼注射液中游离肼的含量[J].药物分析杂志，2017，37（02）：316-319.
[4]张杨慧，蒋孟虹，秦峰，等.柱后衍生化-HPLC法测定硫酸卡那霉素注射液及滴眼液的含量[J].中国抗生素杂志，2019，44（01）：88-93.
[5]苏小洁，潘显茂.用免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱荧光法检测山楂干中多种黄曲霉毒素含量的效果观察[J].当代医药论丛，2018，16（16）：189-190.
关键词：高效液相色谱法;药物;有效成分
药物中的有效成分含量多少以及有效成分种类在评估药物质量与真伪中非常重要，鉴定、检测药物中的有效成分在药品质量控制中应用广泛。高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）法是药品有效成分分离与分析的常用方法，但是仪器的荧光、紫外检测器对药物中的醇类、氨基酸类、羧酸类以及脂肪酸类有效成分检测效果并不理想。衍生化技术将药品中的成分衍生化为合适的成分来进行检测，这使得HPLC的检测范围得到了扩大，也提高了检测灵敏度。
1、衍生化HPLC
衍生化（derivatization）技术采用试剂将样本中的待分析物转化为更适合的物质形式，从而为检测提供方法。衍生化技术能够消除基质的干扰，增强离子化效率或者改变分析物的理化性质，能够提高物质的分离程度，使得目标选择性与检测仪器的灵敏度得到提高[1]。衍生化HPLC在生物、环境、食品以及医药等各个领域的痕量分析物检测中均应用广泛。
从衍生有没有与HPLC联机的角度划分，可以将化学衍生法分为离线与在线两种;根据衍生化反应的发生部位来划分，可以将其划分为柱前、柱中以及柱后衍生化法。在线柱中衍生化法在手性药物分离对映体中应用广泛，其根据药物与衍生化试剂对映体的反应来形成非对映体的产物;衍生化法改变药物成分的官能团，从而使其具有理想的荧光检测信号与紫外检测信号，提高检测灵敏度与检测范围。上述两种原理不同，因此文章中仅对当前应用广泛的在线柱后衍生化法与柱前衍生化进行讨论。
2、常用衍生化HPLC法的应用现状
2.1 柱前衍生化法
柱前衍生化反应容易操作，可以采用手工离线的方法实现样品的纯化与反应，对容积、混合试剂的要求不高，对试剂用量、反应条件以及反应时间等都要求不高。该方法能提高检测的灵敏度，还有助于提高色譜分辨率与分离方法的选择性。
对氨基酸类药物进行测定时，2，4-二硝基氟苯是最常用的试剂。醇类是表面活性剂的关键原料之一，特别是脂肪醇乙氧基化合物在化妆品行业与药物中都应用广泛，其对环境具有一定污染性。对醇类化合物的测定方法进行优化，其应用价值较高。陈哲等[2]建立柱前衍生反相HPLC对珐菲亚中的14种氨基酸进行同时测定，衍生化试剂为异硫氰酸苯酯，建立了14种氨基酸同时测定的方法。李滋等[3]采用苯甲醛作为衍生化试剂，对异烟肼注射液中游离胫的含量进行检测，发现游离胫检出限为0.5g/ml，为异烟肼注射液质控提供了检测方法。
2.2 柱后衍生化法
这一反应在检测器与色谱柱之间的反应器完成，其属于在线衍生化方法。就反应器方面，由不锈钢、聚四氟乙烯、玻璃等制成的管状反应器是最为简单的反应器，可以应用于滞留时间不超过30s的快速反应。例如将邻苯二甲醛（OPA）作为柱后衍生试剂，与氨基酸发生反应，能够尽可能避免柱前手动衍生物可能存在的不稳定因素，该方法的灵敏度与分辨率均较高。柱床反应器适用于1-5min滞留时间的中等速度的反应，其在反应器内填充固定化酶制成稳定的柱床，通入底物溶液，流动相经过玻珠时与玻珠上的衍生化反应物发生反应，根据一定流速来收集转化液。载流式反应器适用于滞留时间在5min以上的反应，其盘管细长，出于减少峰扩张的目的，试剂与洗脱液混合的过程中要将空气不断打入，或者打入不溶于流动相的容积，从而促使溶液在分割的情况下流动，这一方法可维持峰扩张不超过10%。除此之外，光化学检测反应器适用于一些仅需光照即可完成结构变化的反应物。
就柱后衍生化的试剂选择方面，OPA是氨基酸、胺的柱后衍生化试剂，其与氨基酸发生反应，生成荧光衍生物，其具有快速、灵敏的特点，检测效果良好，是柱后衍生化的常用试剂。张杨慧等[4]应用OPA进行柱后衍生化，建立了硫酸卡那霉素注射液及滴眼液含量的检测方法，发现卡那霉素在0.0973-583.8g/ml浓度范围内的线性关系良好（r=0.9999）。苏小洁[5]采用浓度0.05%的碘溶液作为衍生试剂，采用免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱荧光法检测山楂黄曲霉素B1、B2、G1、G2含量，发现其最低检出限分别为0.6pg、0.1pg、0.7pg、0.2pg。
3、结论
衍生法HPLC以柱前衍生化法与柱后衍生化法比较常用。前者优点众多，但是部分衍生化后的部分化合物反应产物种类较多，这使得样品组分有时候会出现多个色谱峰而使得色谱图变得非常复杂，因此柱前衍生化法的应用有一定限制。柱后衍生化法在经过色谱柱分离后、进入检测器前进行，因此这一方法可以连续、自动地进行，具有容易操作的优势。由于该方法在分离后完成衍生化，这使得色谱分离能将样品自身的性质反应出来。柱后衍生化法也存在一定限制，例如要求衍生化反应具有良好重现性，要求控制反应时间，还要求过量衍生试剂与反应后生成的副产物不能对检测造成影响，受到这些限制，柱后衍生化法的应用还并不广泛。但是总的来说，衍生化法HPLC的发展前景广阔。
参考文献
[1]何继杰，张晓凤，钱莉莉，等.痕量氨基酸分析方法研究进展[J].分析科学学报，2019，35（04）：507-513.
[2]陈哲，路娟，彭纪铭，等.柱前衍生RP-HPLC法同时测定珐菲亚中14种水解氨基酸[J].药学实践杂志，2017，35（02）：130-133.
[3]李滋，于润芳，侯宁，等.柱前衍生化HPLC法测定异烟肼注射液中游离肼的含量[J].药物分析杂志，2017，37（02）：316-319.
[4]张杨慧，蒋孟虹，秦峰，等.柱后衍生化-HPLC法测定硫酸卡那霉素注射液及滴眼液的含量[J].中国抗生素杂志，2019，44（01）：88-93.
[5]苏小洁，潘显茂.用免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱荧光法检测山楂干中多种黄曲霉毒素含量的效果观察[J].当代医药论丛，2018，16（16）：189-190.