【摘 要】
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[目的]确认大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助因子OrfA与转录因子E2F5的互作关系,以及OrfA对肿瘤细胞增殖的影响.[方法]采用重组DNA技术构建orfA与E2F5基因过表达载体;通过Western Blot试验,检测对比HEK293T、Hela229宫颈癌细胞、A375恶性黑色素瘤细胞、SMMC-7721肝癌细胞和SPC-A-1肺腺癌细胞中E2F5的表达量;通过酵母双杂交和免疫共沉淀试验,验证OrfA与E2F5的互作关系;采用CCK-8试剂盒和PI单染色法,检测过表达orfA基因对SPC-A-
【机 构】
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西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100
【出 处】
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西北农林科技大学学报（自然科学版）
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[目的]确认大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助因子OrfA与转录因子E2F5的互作关系,以及OrfA对肿瘤细胞增殖的影响.[方法]采用重组DNA技术构建orfA与E2F5基因过表达载体;通过Western Blot试验,检测对比HEK293T、Hela229宫颈癌细胞、A375恶性黑色素瘤细胞、SMMC-7721肝癌细胞和SPC-A-1肺腺癌细胞中E2F5的表达量;通过酵母双杂交和免疫共沉淀试验,验证OrfA与E2F5的互作关系;采用CCK-8试剂盒和PI单染色法,检测过表达orfA基因对SPC-A-1细胞增殖的影响;采用RT-qPCR,检测过表达orfA基因对SMAD4和caspase-3基因表达的影响.[结果]成功构建了 orfA与E2F5基因过表达载体pLenti-EF1α-orfA和pLenti-EF1α-E2F5;在5种细胞系中,以SPC-A-1细胞E2F5蛋白表达量最高;酵母双杂交和免疫共沉淀试验结果均证明,OrfA与E2F5可以直接相互作用;过表达orfA基因对SPC-A-1细胞增殖具有显著促进作用,同时能够增强SMAD4基因的表达,抑制caspase-3基因的表达.[结论]WDSV OrfA与E2F5有相互作用,且能促进SPC-A-1肺腺癌细胞的增殖.
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