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摘要 [目的]选育抗褐飞虱水稻两系不育系。[方法]以B5为供体材料，采用分子标记辅助选择，将B5所含的Bph14和Bph15基因导入两系不育系1892S，获得符合两用核不育系标准的株系S136、S179、S192。[结果]分子标记检测结果表明，3个株系分别携带Bph14+Bph15；人工接虫鉴定结果显示，3个两系不育系都高抗褐飞虱。[结论]该研究为进一步选育抗褐飞虱杂交稻组合提供了亲本材料。
关键词 水稻；两系不育系；抗褐飞虱；分子标记辅助选择；选育
中图分类号 S503.5文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）20-107-02
Abstract [Objective] The TGMS Line with the resistance to brown planthopper was bred. [Method] The gene： Bph14 and Bph15， contained in rice material-B5 was transferred into the TGMS Line 1892S by means of marker-assisted selection （MAS） and three TGMS lines （S136， S179 and S192） were successfully developed. [Result] The result of molecular test and evaluation showed that three lines were with the Bph14 and Bph15 and the identification in artificial inoculation of insect indicated that the resistance of three lines to BPH was high. [Conclusion] The rice material was provided for the breeding of the hybrid rice combination with the resistance to BPH.
Key words Rice； TGMS line； Brown planthopper； MAS； Breeding
褐飞虱（Brown rice planthopper）是我国和许多亚洲国家水稻的主要害虫之一[1]。目前防治的主要手段是药物防治，对环境破坏较大。选育抗褐飞虱品种是防治褐飞虱最经济有效的方法[2]。随着分子技术的快速发展，分子标记辅助选育抗褐飞虱品种越来越受到重视[3]。研究表明，有30 个抗褐飞虱基因被发现，利用这些基因选育抗褐飞虱品种已成为防治的关键。武汉大学用药用野生稻转育的B5 含有2 个抗褐飞虱主效显性基因Bph14 和Bph15，分别被定位在第3 染色体长臂和第4染色体短臂上[4]。1892S是安徽省农业科学院水稻研究所选育的两系不育系，株叶形态好，米质优，所配组合产量高，抗倒伏性好但高感褐飞虱[5]。笔者用B5 作为抗源，以1892S为受体，利用插入缺失标记（InDel）76-2 和SSR 标记MS5进行辅助选择[6-7]，选育出含有Bph14 和Bph15两系不育系新材料S136、S179、S192，接虫鉴定对褐飞虱表现出较好的抗性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
抗褐飞虱抗源为B5[2]（携带抗褐飞虱基因Bph14和Bph15），受体亲本为1892S（安徽省农业科学院水稻研究所选育）。
1.2 抗性基因连锁标记
为了获得抗褐飞虱两系不育系，在改良过程中，利用已开发的插入缺失标记（InDel）76-2和SSR标记MS5在分离群体中进行跟踪检测。相关引物序列由上海生工生物技术服务有限公司合成（表1）。
1.3 抗虫鉴定
抗虫鉴定在人工简易温室内进行。采用标准苗期集团筛选法进行：供试两系不育系种子催芽后分别播种在塑料盆内（60 cm×40 cm×15 cm），每个不育系插一行，每行15 株，设3个重复，随机排列，以TN1 作为感虫对照。当稻苗长至2 叶1 心时间苗，每行保留10 株，每株接褐飞虱2～3 龄若虫5～7头。参考文献[8]对供试不育系进行抗性评价。
2 结果与分析
2.1 分子标记辅助选择体系
利用与Bph14相关的插入缺失标记76-2和与Bph15相关的SSR标记MS5对抗性基因供体亲本B5与受体亲本1892S进行多态性分析（图1）。插入缺失标记76-2在供体亲本中扩增出的产物较大，受体亲本较小，供体和受体之间表现出明显的多态性。SSR标记MS5在供体和受体间也表现出明显的多态性。
2.2 抗褐飞虱两系不育系选育
利用插入缺失标记76-2和SSR标记MS5对基因Bph14和Bph15在不同分离时代进行筛选（图2）。由于1892S是两系不育系，不育基因的遗传受一对隐性基因控制，F2表现出可育株和不育系的分离。在F2代中，选择株叶形态好、株头外露率高、符合不育系特性的不育株，取其叶片进行检测，保留含有Bph14和Bph15的单株，割蔸再生，23 ℃恒温冷灌处理，收获种子。种植F3，在F3中继续对Bph14和Bph15进行检测，淘汰不符合要求的单株，符合要求的单株割蔸再生。经过连续筛选，至2015年晚季株系S136、S179、S192已基本稳定。选育流程见图3。
2.3 抗性鉴定
鉴定结果表明，含有Bph14和Bph15 2个基因之一或者2个基因均含的株系对褐飞虱表现出较好的抗性，其中，7、8、11号3个株系含有2个基因，表现出高抗水平，说明聚合多个抗性基因对抗性有累加作用，追踪7、8和11号株系田间代号，分别命为S136、S179和S192（表2）。 2.4 抗褐飞虱两系不育系育性
1892S属光温敏核不育系，不育期花粉败育类型表现为无或少花粉型[5]。3个改良不育系无论在人工恒温水冷灌处理条件下还是自然条件下，花粉败育类型均表现为无或少花粉型，自交结实率全部为0。新选育的S136、S179、S192 3个不育系经鉴定，不育起点温度低于23.5 ℃，符合两用核不育系应用标准。
3 结论与讨论
选育抗褐飞虱杂交水稻是防治褐飞虱最有效的途径，随着分子技术的发展，一系列抗褐飞虱基因的定位及其标记的开发已成为水稻抗性育种最重要的手段之一。含有Bph14和Bph15的B5是武汉大学选育的抗褐飞虱亲本，育种家们利用该材料已选育出多个品种（材料），经生产推广检验对褐飞虱具有抗性[1，6-7]。
抗性育种一般采取一次杂交、多次回交方法，保留原始亲本株叶形态[7]。该研究则通过一次杂交，F2代大群体（4 000株以上）选择，尽可能多地选择不同株叶形态单株，然后借助MAS与传统育种技术结合，基于农艺性状的表现，将抗性、株型（包括柱头外露率）和育性同时选择，最终选育出S136、S179、S192 3个两系不育系株系，其不但与1892S在株叶形态上存在明显差别，同时育性符合两系不育系的要求。
在抗褐飞虱鉴定中，不少含Bph14或Bph15株系也表现高抗水平，如3、4、5、13、15、16号株系。一般而言，单基因控制的水稻品种抗性更容易丧失，但只要这些材料与同样含有其他抗褐飞虱基因的父本配组，聚合2个以上抗性基因，同样具有应用价值。笔者发现引自湖南杂交水稻工程技术中心的R318也含Bph15，与含Bph14的5、6、13、16号株系配组，同样聚合了2个抗性基因[1]。
下一步研究重点以S136、S179、S192 3个两系不育系株系为亲本材料，选育一批抗褐飞虱两系杂交水稻新组合供生产推广应用。
参考文献
[1] 程攀，陈龙，曲姗姗，等.抗褐飞虱水稻品种选育研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（24）：92-94.
[2] 林拥军，华红霞，何予卿，等.水稻褐飞虱综合治理研究与示范[J].应用昆虫学报，2011，48（5）：1194-1201.
[3] 黄所生，黄凤宽，吴碧球，等.水稻新品种（组合）对褐飞虱的抗性评价[J].西南农业学报，2014（5）：1919-1923.
[4] 王布哪，黄臻，舒理慧，等.两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子定位[J].科学通报，2001，46（1）：46-49.
[5] 杨联松，白一松.籼型优质光温敏核不育系1892S的选育[J].杂交水稻，2006，21（3）：15-16.
[6] 李进波，万丙良，夏明元，等.抗褐飞虱水稻品种的培育及其抗性表现[J].应用昆虫学报，2011，48（5）：1348-1353.
[7] 朱仁山，黄文超，胡骏，等.抗褐飞虱两系杂交水稻不育系Bph68S及其组合两优234的选育[J].武汉大学学报，2013（1）：24-28.
[8] 钱前，郭龙彪，曾大力，等.水稻分子育种技术指南[M].北京：科学出版社，2012：40-45.
关键词 水稻；两系不育系；抗褐飞虱；分子标记辅助选择；选育
中图分类号 S503.5文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）20-107-02
Abstract [Objective] The TGMS Line with the resistance to brown planthopper was bred. [Method] The gene： Bph14 and Bph15， contained in rice material-B5 was transferred into the TGMS Line 1892S by means of marker-assisted selection （MAS） and three TGMS lines （S136， S179 and S192） were successfully developed. [Result] The result of molecular test and evaluation showed that three lines were with the Bph14 and Bph15 and the identification in artificial inoculation of insect indicated that the resistance of three lines to BPH was high. [Conclusion] The rice material was provided for the breeding of the hybrid rice combination with the resistance to BPH.
Key words Rice； TGMS line； Brown planthopper； MAS； Breeding
褐飞虱（Brown rice planthopper）是我国和许多亚洲国家水稻的主要害虫之一[1]。目前防治的主要手段是药物防治，对环境破坏较大。选育抗褐飞虱品种是防治褐飞虱最经济有效的方法[2]。随着分子技术的快速发展，分子标记辅助选育抗褐飞虱品种越来越受到重视[3]。研究表明，有30 个抗褐飞虱基因被发现，利用这些基因选育抗褐飞虱品种已成为防治的关键。武汉大学用药用野生稻转育的B5 含有2 个抗褐飞虱主效显性基因Bph14 和Bph15，分别被定位在第3 染色体长臂和第4染色体短臂上[4]。1892S是安徽省农业科学院水稻研究所选育的两系不育系，株叶形态好，米质优，所配组合产量高，抗倒伏性好但高感褐飞虱[5]。笔者用B5 作为抗源，以1892S为受体，利用插入缺失标记（InDel）76-2 和SSR 标记MS5进行辅助选择[6-7]，选育出含有Bph14 和Bph15两系不育系新材料S136、S179、S192，接虫鉴定对褐飞虱表现出较好的抗性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
抗褐飞虱抗源为B5[2]（携带抗褐飞虱基因Bph14和Bph15），受体亲本为1892S（安徽省农业科学院水稻研究所选育）。
1.2 抗性基因连锁标记
为了获得抗褐飞虱两系不育系，在改良过程中，利用已开发的插入缺失标记（InDel）76-2和SSR标记MS5在分离群体中进行跟踪检测。相关引物序列由上海生工生物技术服务有限公司合成（表1）。
1.3 抗虫鉴定
抗虫鉴定在人工简易温室内进行。采用标准苗期集团筛选法进行：供试两系不育系种子催芽后分别播种在塑料盆内（60 cm×40 cm×15 cm），每个不育系插一行，每行15 株，设3个重复，随机排列，以TN1 作为感虫对照。当稻苗长至2 叶1 心时间苗，每行保留10 株，每株接褐飞虱2～3 龄若虫5～7头。参考文献[8]对供试不育系进行抗性评价。
2 结果与分析
2.1 分子标记辅助选择体系
利用与Bph14相关的插入缺失标记76-2和与Bph15相关的SSR标记MS5对抗性基因供体亲本B5与受体亲本1892S进行多态性分析（图1）。插入缺失标记76-2在供体亲本中扩增出的产物较大，受体亲本较小，供体和受体之间表现出明显的多态性。SSR标记MS5在供体和受体间也表现出明显的多态性。
2.2 抗褐飞虱两系不育系选育
利用插入缺失标记76-2和SSR标记MS5对基因Bph14和Bph15在不同分离时代进行筛选（图2）。由于1892S是两系不育系，不育基因的遗传受一对隐性基因控制，F2表现出可育株和不育系的分离。在F2代中，选择株叶形态好、株头外露率高、符合不育系特性的不育株，取其叶片进行检测，保留含有Bph14和Bph15的单株，割蔸再生，23 ℃恒温冷灌处理，收获种子。种植F3，在F3中继续对Bph14和Bph15进行检测，淘汰不符合要求的单株，符合要求的单株割蔸再生。经过连续筛选，至2015年晚季株系S136、S179、S192已基本稳定。选育流程见图3。
2.3 抗性鉴定
鉴定结果表明，含有Bph14和Bph15 2个基因之一或者2个基因均含的株系对褐飞虱表现出较好的抗性，其中，7、8、11号3个株系含有2个基因，表现出高抗水平，说明聚合多个抗性基因对抗性有累加作用，追踪7、8和11号株系田间代号，分别命为S136、S179和S192（表2）。 2.4 抗褐飞虱两系不育系育性
1892S属光温敏核不育系，不育期花粉败育类型表现为无或少花粉型[5]。3个改良不育系无论在人工恒温水冷灌处理条件下还是自然条件下，花粉败育类型均表现为无或少花粉型，自交结实率全部为0。新选育的S136、S179、S192 3个不育系经鉴定，不育起点温度低于23.5 ℃，符合两用核不育系应用标准。
3 结论与讨论
选育抗褐飞虱杂交水稻是防治褐飞虱最有效的途径，随着分子技术的发展，一系列抗褐飞虱基因的定位及其标记的开发已成为水稻抗性育种最重要的手段之一。含有Bph14和Bph15的B5是武汉大学选育的抗褐飞虱亲本，育种家们利用该材料已选育出多个品种（材料），经生产推广检验对褐飞虱具有抗性[1，6-7]。
抗性育种一般采取一次杂交、多次回交方法，保留原始亲本株叶形态[7]。该研究则通过一次杂交，F2代大群体（4 000株以上）选择，尽可能多地选择不同株叶形态单株，然后借助MAS与传统育种技术结合，基于农艺性状的表现，将抗性、株型（包括柱头外露率）和育性同时选择，最终选育出S136、S179、S192 3个两系不育系株系，其不但与1892S在株叶形态上存在明显差别，同时育性符合两系不育系的要求。
在抗褐飞虱鉴定中，不少含Bph14或Bph15株系也表现高抗水平，如3、4、5、13、15、16号株系。一般而言，单基因控制的水稻品种抗性更容易丧失，但只要这些材料与同样含有其他抗褐飞虱基因的父本配组，聚合2个以上抗性基因，同样具有应用价值。笔者发现引自湖南杂交水稻工程技术中心的R318也含Bph15，与含Bph14的5、6、13、16号株系配组，同样聚合了2个抗性基因[1]。
下一步研究重点以S136、S179、S192 3个两系不育系株系为亲本材料，选育一批抗褐飞虱两系杂交水稻新组合供生产推广应用。
参考文献
[1] 程攀，陈龙，曲姗姗，等.抗褐飞虱水稻品种选育研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（24）：92-94.
[2] 林拥军，华红霞，何予卿，等.水稻褐飞虱综合治理研究与示范[J].应用昆虫学报，2011，48（5）：1194-1201.
[3] 黄所生，黄凤宽，吴碧球，等.水稻新品种（组合）对褐飞虱的抗性评价[J].西南农业学报，2014（5）：1919-1923.
[4] 王布哪，黄臻，舒理慧，等.两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子定位[J].科学通报，2001，46（1）：46-49.
[5] 杨联松，白一松.籼型优质光温敏核不育系1892S的选育[J].杂交水稻，2006，21（3）：15-16.
[6] 李进波，万丙良，夏明元，等.抗褐飞虱水稻品种的培育及其抗性表现[J].应用昆虫学报，2011，48（5）：1348-1353.
[7] 朱仁山，黄文超，胡骏，等.抗褐飞虱两系杂交水稻不育系Bph68S及其组合两优234的选育[J].武汉大学学报，2013（1）：24-28.
[8] 钱前，郭龙彪，曾大力，等.水稻分子育种技术指南[M].北京：科学出版社，2012：40-45.