【摘 要】
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【目的】本研究旨在了解腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)壳聚糖酶的基本酶学性质及其在壳寡糖生产中的应用,构建能高效分泌表达壳聚糖酶的酿酒酵母工业菌株。【方法】采用RT-PCR
【机 构】
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山东大学微生物技术国家重点实验室;
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【目的】本研究旨在了解腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)壳聚糖酶的基本酶学性质及其在壳寡糖生产中的应用,构建能高效分泌表达壳聚糖酶的酿酒酵母工业菌株。【方法】采用RT-PCR扩增腐皮镰孢菌壳聚糖酶的cDNA序列;通过组氨酸标签,纯化得到E.coli表达的重组壳聚糖酶,并进行基本酶学性质研究;以薄层层析、高效液相色谱等技术对该酶的酶解产物进行分析;通过马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菊粉酶信号肽(INU1A)实现壳聚糖酶在酿酒酵母工业菌株N-27中的分泌表达,得到高效分泌壳聚糖酶的重组工业菌株N-27C。【结果】所得到的壳聚糖酶cDNA序列(GenBank,EU263917)含有一个长为903bp的开放读码框,编码300个氨基酸残基。E.coli重组壳聚糖酶的最适温度为50℃,最适pH值为5.6,Km值为0.063mg/mL;该酶的水解产物中不含单糖,10糖以下组分占75%以上。酶活测定结果表明壳聚糖酶基因能在酿酒酵母中分泌表达,体积酶活达到50.2mU/mL。【结论】腐皮镰胞菌壳聚糖酶是一种内切型壳聚糖酶,在功能性壳寡糖的生产中具有良好的应用前景,分泌型表达该酶的酿酒酵母工业菌株对于该酶的规模化生产具有潜在用途。
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