蛋白质的突变体是研究其结构和功能的基础，该研究旨在建立一种高效、快捷的多位点突变体构建方法。当要突变4个及以上相邻的氨基酸残基时，设计两长两短 (长引物Ⅰ/Ⅲ、短引物Ⅱ/Ⅳ) 4条引物：长引物包含突变位点，且突变碱基数≤20 bp，短引物不包含突变位点；两条引物的GC含量≤80%、退火温度之差≤40 ℃，分别以Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ两对引物和模板进行两组反向PCR扩增。扩增后各体系均可得到含有突变位点的非甲基化线性质粒，且以Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ为引物扩增得到的两组线性质粒的断开位点分布在突变位点两侧。用DpnⅠ酶切回收后等摩尔比混合的PCR产物除去甲基化模板，再进行一轮变性和退火处理，两组线性质粒在95 ℃变性后互相以来自对方的单链DNA为模板退火形成开环质粒，转化大肠杆菌感受态细胞即可得到包含突变位点的转化子。结果表明，该方法可同时突变4–11个连续氨基酸残基 (8–20 bp)，将大幅简化多位点突变体的构建，从而进一步提高蛋白质结构和功能研究的效率。