目的:由于技术原理的限制,目前尚不能对所有的HLA等位基因进行严格的区分,特别是以往没有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决,然而,当遇到等位基因杂合时,测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧,这时需要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列.采用基因克隆方法确认HLA新等位基因.方法:实验于2006-01/05在河南省红十字血液中心HLA实验室,美国海军骨髓库HLA实验室完成.造血干细胞血样由中华骨髓库提供.采用荧光微珠HLA分型方法对中华骨髓库捐献者血样进行HLA分型检测,无法给出确切结果的摸棱两可结果标本用基因克隆(TOPO TA Cloning)、DNA测序的方法确认新的HLA基因序列.结果:通过克隆分离杂合等位基因,再进行测序确认发现新的序列与B*3709相比,出现4个核苷酸改变:1.355nt C＞A,2.363nt C＞G,3.412ntG＞A,4.477nt C＞G,而且均发生在HLA-B基因外显子3(exon 3).4处改变引起氨基酸编码改变:①编码95 CTC＞ATC,氨基酸改变L＞I(亮氨酸＞异亮氨酸).②97 AGC＞AGG,S＞R(丝氨酸＞精氨酸).③114 GAC＞AAC D＞N(天门冬氨酸＞天冬酰胺).④135 GCC＞GCG A=A无氨基酸改变.结论:①新的基因序列已经在GenBnak注册,被WHO的HLA因子命名委员会得到正式命名为HLA-B*3712基因.②基因克隆是确认HLA新基因的根本方法.