CGRP修饰的间充质干细胞及其CGRP受体对血管平滑肌细胞增殖及表型转化的影响

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目的

观察降钙素基因相关肽(CGRP)修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)与血管平滑肌细胞(VSMCs)共培养后,MSCs分泌的CGRP对VSMCs增殖及表型转化的影响及其具体的作用机制。

方法

将携带CGRP的慢病毒载体转染MSCs(MSCsCGRP+/+),单纯慢病毒及PBS转染MSCs作为对照,应用ELISA法检测CGRP蛋白表达;携带RAMP1及shRAMP1的慢病毒载体转染VSMCs,实验分为Lenti-GFP-hRAMP1转染组(RAMP1+/+组)、Lenti-GFP-shRAMP1转染组(RAMP1-/-组)、Lenti-GFP转染组(GFP+/+组)和PBS转染对照组,应用Western印迹技术检测各组VSMCs中RAMP1蛋白表达。然后将MSCsCGRP+/+与过表达RAMP1及沉默RAMP1的VSMCs共培养,实验分为MSCs+VSMCs组、MSCsCGRP+/++ VSMCs组、MSCsCGRP+/++ VSMCsRAMP1+/+组、MSCsCGRP+/++ VSMCs RAMP1-/-4组;应用流式细胞术检测细胞增殖周期,MTT法检测细胞增殖率,Western印迹技术检测VSMCs收缩蛋白(α-SM-actin)和合成型骨桥蛋白(OPN)的表达。

结果

过表达CGRP的MSCs其培养基中CGRP的表达量较对照组明显增加(19.530±0.498比3.133±0.160 and 3.120±0.001,P<0.05);过表达RAMP1及shRAMP1的慢病毒载体转染VSMCs后,RAMP1+/+组的RAMP1表达最多,而RAMP1在RAMP1-/-组表达最少。MSCs与VSMCs共培养后72 h,与MSCsCGRP+/++ VSMCs组比较,MSCsCGRP+/++ VSMCsRAMP1+/+组VSMCs增殖率明显增强(0.270±0.263与0.413±0.070, P<0.05),停留在静止期的细胞数相对增加[(93.51±0.38)%与(84.48±0.31)%,P<0.05],α-SM-actin表达显著增加(102 946±3847与51 759±635,P<0.05),OPN表达明显降低(26 026±2595与44 201±2811,P<0.05);然而沉默VSMCs中的RAMP1后,MSCsCGRP+/+与VSMCs共培养后72 h,CGRP抑制VSMCs的增殖能力较过表达RA MP1的VSMCs明显减弱(0.601±0.04与0.270±0.263,P<0.05),静止期的细胞数量减少[(78.57±0.68)%与(93.51±0.38)%,P<0.05],OPN蛋白表达增加(53 933±1192与26 026±2595,P<0.05),α-SM-actin表达减少(34 400±2179与102 946±3847,P<0.05)。

结论

CGRP转染MSCs后,细胞能分泌目的CGRP蛋白。CGRP修饰MSCs能明显抑制VSMCs的表型转化及细胞增殖,这可能与CGRP受体表达上调增强CGRP效应性有关。

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