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摘要：
目的：探讨青蛤内脏碱性蛋白酶水解物的体外抗氧化活性。方法：利用正交实验确定青蛤内脏碱性蛋白酶的最佳酶解条件，测定水解物对清除DPPH自由基、清除超氧自由基、螯合力和还原铁的能力。结果：水解物抗氧化活性最大的影响因素为pH值，最小的影响因素为水解时间，且当温度为50℃、时间为4h、加酶量为2000 u/g、pH为9时，水解物的抗氧化活性最强。在最佳抗氧化水解条件下得到的水解物，对羟自由基、DPPH自由基、Fe2+离子的螯合作用均有一定的清除活性。结论：碱性蛋白酶对青蛤水解得到的水解物具有较好的抗氧化活性。
关键词：青蛤； 抗氧化性；清除率
【中图分类号】
R453 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）05-0042-02
1 前言
青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））分布于我国沿海潮间带的泥砂滩中，肉质鲜美、营养丰富，经济价值颇高，倍受消费者的青睐价值[1]。目前，随着海洋生物研究的深入开发和研究技术的提高，从海洋生物中寻找新的天然抗氧化剂已成为海洋药物研究的重要目标之一[2]。应用蛋白酶对生物蛋白质进行水解，其水解的溶液中含有大量活性肽和氨基酸，如牛磺酸、胱氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸都具有抗氧化能力。我国已从动植物（如鲢鱼[3]、牡蛎[4]等）中用酶解的方法获取大量活性肽。但有关青蛤内脏碱性蛋白酶水解物的抗氧化活性实验报道不多，本文是以新鲜青蛤为原料，利用酶解其肉糜所得的水解液进行清除DPPH自由基、清除超氧自由基、螯合和还原铁的研究。
2材料与仪器
2.1实验原料及试剂：
新鲜的青蛤，购于舟山市场，去壳后，-20℃冰箱冷藏备用；碱性蛋白酶194000 u / g，工业级，北京亚太恒信生物科技有限公司；邻二氮菲、DPPH、铁氰化钾购自上海晶纯试剂有限公司，其余试剂为分析纯均购置国药集团化学试剂有限公司。
2.2仪器：BSA1245型电子天平 中国，赛多利斯科学仪器有限公司；
CF16RXⅡ高速冷冻离心机 日本，HITACHZ公司；
UV-1600PC型 紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；
SSW型微电脑电热恒温水槽 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
3实验方法
3.1正交实验：
参照文献[5] ，选用碱性蛋白酶，考虑到1（温度）、2（时间）、3（加酶量）、4（pH）四个因素，每个因素选三个水平进行四个因素的正交实验，比较碱性蛋白酶在不同水解条件下的DPPH自由基清除率，从而确定碱性蛋白酶的最佳水解条件。
水解液的制备：青蛤→除去外壳取内脏→内脏破碎→以1∶ 3比例加水→加入碱性蛋白酶→水解→沸水灭活→放置冷却→10000r /min离心10min→取上清液→冷冻干燥→DPPH自由基清除率测定。
3.2对DPPH自由基的清除作用：
按照文献[6-8]进行DPPH自由基清除活性测定。配置DPPH浓度0.1 mmol/L（无水乙醇溶解）避光保存。方法：1mL样品+1mLDPPH，混合均匀，避光保存30min，4000r/min离心10min，517nm处测吸光度Ai[9]。同时测1mL无水乙醇+1mL样品混合的测吸光度Aj，和1mLDPPH+1mL水混合测吸光度Ac。
DPPH清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%
3.3对羟自由基清除率的测定：
参考文献[10-12]所述的方法，并做了适当调整。取浓度为0.75 mmol/L邻二氮菲1mL在试管中，并且按顺序加入pH值为7.4的磷酸缓冲液（PBS）2mL，样品溶液1ml，充分混匀，然后加入浓度为0.75 mol/L的硫酸亚铁1mL，混匀，加入0.03%双氧水1mL，37℃水浴1小时，于536nm处测其吸光度As；空白组用水代替双氧水，为Ab；损伤组用水代替样品，为Ap。
清除率（%）=[（As-Ap）/（Ab-Ap）]×100%
3.4对Fe2+离子的螯合作用：
将干净的具塞试管中分别依次加入不同质量浓度的受试样品（3mg/mL～20mg/mL）0.5mL， 20μM FeCl2溶液1 mL，混匀后加入0.5 mM ferrozine 1 mL，25℃反应20min后于562 nm处测定吸光度Ab[13]；空白组以水代替样品，为Ac。
螯合力（%）=（1-Ab/Ac）×100%
3.5还原能力的测定：参考文献 [14]并略有改动。将干净的具塞试管中分别依次加人样品1mL，另加入1mL Tris-HCl （0.2 mol/L，pH=6.6 ）及1%铁氰化钾2.5 mL，混匀后于50℃水浴20 min，然后加入10%三氯乙酸1.5 mL，混匀后3000 r/min离心10 min。精确移取上层清液2.0 mL，加入蒸馏水2.0 mL和0.1%三氯化铁0.5 mL，混匀后放置10min，于700 nm处测定吸光度值A，吸光度值越大表明还原力越强[15]。
4 结果与分析
4.1 正交实验结果：为了得到具有最佳抗氧化活性的碱性蛋白酶水解物，本实验以DPPH清除率为指标，进行4因素3水平L9（3）4的正交实验，结果见表1。
由表1可知，影响碱性蛋白酶水解物抗氧化活性的各因素排列順序为D>A>C>B，即pH值影响最大，水解时间影响最小；碱性蛋白酶水解物抗氧化性最强的水解条件为A3B1C3D1。因此，本实验选择的温度为50℃、时间4h、加酶量2000 u/g、pH9作为最佳水解条件。 4.2水解物对DPPH自由基的清除率：将最佳水解条件下得到的水解物冷冻干燥，检测样品浓度为1mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL时碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基的清除率。结果见图1所示，碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基的清除率随着浓度的升高而增大，当浓度为5mg/mL
时，清除率达到91.24%。
4.3 水解物对羟自由基清除率：同样设置5个浓度组，即2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，分别检测其对羟自由基的清除率。结果见图2所示，不同浓度的碱性蛋白酶水解物对羟自由基均有一定程度的清除作用，并且随着浓度升高，清除率增大，对羟自由基的清除率低于DPPH，当浓度为10 mg/mL时，清除率为74.84%。
4.5 水解物的还原能力：同樣设置6个浓度组，即1 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL 、20 mg/mL，分别检测其还原力。根据“3.5”还原力的测定方法，在700 nm处的吸光度越大，水解物的还原能力越强。结果见图4所示，在所设置的浓度范围内，随着浓度增大，还原力增强，即呈现浓度依赖性。
〖XCG34.TIF〗
图4 碱性蛋白酶水解物的还原力
5结论
本试验采用正交实验方法研究碱性蛋白酶对青蛤进行水解时各因素及水平对抗氧化活性的影响。结果显示，水解物抗氧化活性最大的影响因素为pH值，最小的影响因素为水解时间，且当温度为50℃、时间为4h、加酶量为2000 u/g、pH为9时，水解物的抗氧化活性最强。在最佳抗氧化水解条件下得到的水解水解物，对羟自由基、DPPH自由基、Fe2+离子的螯合作用均有一定的清除活性，且该水解物对自由基的清除率和还原力均呈现浓度依赖性。本试验研究表明：碱性蛋白酶对青蛤水解得到的水解物具有较好的抗氧化活性。这为青蛤酶解物的产业化开发提供科学的理论依据。
参考文献
[1] 王兴强，阎斌罗，董双林等.青蛤的生物学及其繁殖[J].水产科学，2006，25（6）：312-316.
[2] 曾庆祝，曾庆孝.海洋贝类 （牡蛎、扇贝、文蛤等）功能性食品的开发利用[J].氨基酸和生物资源， 2002（3）：31-341.
[3] 许庆陵，曾庆祝.鲢酶解物对羟自由基的清除作用[J].大连水产学院水产学报，2002， 28（1）： 93-991.
[4] 欧成坤，杨瑞金.牡蛎酶解产物的ACE抑制活性和清除自由基活性研究[J].食品工业科技，2005 （3） ： 59-621.
[5] 刘振学，黄仁和，田爱民.实验设计与数据处理[G].化学工业出版社，2001：63-70.
[6] 张尊昕，杨伯伦，刘谦光等.野葛根异黄酮成分的超声萃取及抗氧化作用[J].食品科学，2002，23（5）：31-33.
[7] YINRONG L U， YEAPFOO L. Antioxidant and radical scabengingactivities of polyphenols from apple pomace[J]. Food Chemistry， 2000，68： 81-85.
[8] EONG L P， SHUI G. An investigation of antioxidant capacity of fruits inSingapore markets[J]. Food Chemistry， 2002， 76： 69-75
[9] Brand W， Cuvelier ME & Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity [J]. LWT-Food Science and Technology， 1995， 28-25.
[10] 陈美珍，余杰，郭慧敏等.大豆分离蛋白酶解物清除羟基自由基的研究[J].食品科学，2002，23（1）：43-47.
[11] 杨宁，赵谋明，刘洋等.野生仙人掌多糖抗氧化性研究[J].食品科技，2007（2）：147-150.
[12] 王多宁，张小莉，杨颖等.百合多糖对羟自由基的清除作用[J].陕西中医学院学报，2006，29（4）：53-55.
[13] Gursoy N， Sarikurkcu C， Cengiz M， et al. Antioxidant activities， metal contents， total phenolics and flavonoids of seven Morchella species[J]. Food and Chemical Toxicology，2009，47（9）：2381.
[14] Song LY，Li TF，YuRM，et al.Antionxidant activities of hydrolysates of Arca subcrenata prepared with three proteases[J].Mar Drugs，2008，6（4）：607-619.
[15] Prieto P， Pineda M， Aguilar M. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex： specific application to the determination of vitamin E[J]. Analytical Biochemistry， 1999， 269（2）：337.
目的：探讨青蛤内脏碱性蛋白酶水解物的体外抗氧化活性。方法：利用正交实验确定青蛤内脏碱性蛋白酶的最佳酶解条件，测定水解物对清除DPPH自由基、清除超氧自由基、螯合力和还原铁的能力。结果：水解物抗氧化活性最大的影响因素为pH值，最小的影响因素为水解时间，且当温度为50℃、时间为4h、加酶量为2000 u/g、pH为9时，水解物的抗氧化活性最强。在最佳抗氧化水解条件下得到的水解物，对羟自由基、DPPH自由基、Fe2+离子的螯合作用均有一定的清除活性。结论：碱性蛋白酶对青蛤水解得到的水解物具有较好的抗氧化活性。
关键词：青蛤； 抗氧化性；清除率
【中图分类号】
R453 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）05-0042-02
1 前言
青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））分布于我国沿海潮间带的泥砂滩中，肉质鲜美、营养丰富，经济价值颇高，倍受消费者的青睐价值[1]。目前，随着海洋生物研究的深入开发和研究技术的提高，从海洋生物中寻找新的天然抗氧化剂已成为海洋药物研究的重要目标之一[2]。应用蛋白酶对生物蛋白质进行水解，其水解的溶液中含有大量活性肽和氨基酸，如牛磺酸、胱氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸都具有抗氧化能力。我国已从动植物（如鲢鱼[3]、牡蛎[4]等）中用酶解的方法获取大量活性肽。但有关青蛤内脏碱性蛋白酶水解物的抗氧化活性实验报道不多，本文是以新鲜青蛤为原料，利用酶解其肉糜所得的水解液进行清除DPPH自由基、清除超氧自由基、螯合和还原铁的研究。
2材料与仪器
2.1实验原料及试剂：
新鲜的青蛤，购于舟山市场，去壳后，-20℃冰箱冷藏备用；碱性蛋白酶194000 u / g，工业级，北京亚太恒信生物科技有限公司；邻二氮菲、DPPH、铁氰化钾购自上海晶纯试剂有限公司，其余试剂为分析纯均购置国药集团化学试剂有限公司。
2.2仪器：BSA1245型电子天平 中国，赛多利斯科学仪器有限公司；
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UV-1600PC型 紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；
SSW型微电脑电热恒温水槽 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
3实验方法
3.1正交实验：
参照文献[5] ，选用碱性蛋白酶，考虑到1（温度）、2（时间）、3（加酶量）、4（pH）四个因素，每个因素选三个水平进行四个因素的正交实验，比较碱性蛋白酶在不同水解条件下的DPPH自由基清除率，从而确定碱性蛋白酶的最佳水解条件。
水解液的制备：青蛤→除去外壳取内脏→内脏破碎→以1∶ 3比例加水→加入碱性蛋白酶→水解→沸水灭活→放置冷却→10000r /min离心10min→取上清液→冷冻干燥→DPPH自由基清除率测定。
3.2对DPPH自由基的清除作用：
按照文献[6-8]进行DPPH自由基清除活性测定。配置DPPH浓度0.1 mmol/L（无水乙醇溶解）避光保存。方法：1mL样品+1mLDPPH，混合均匀，避光保存30min，4000r/min离心10min，517nm处测吸光度Ai[9]。同时测1mL无水乙醇+1mL样品混合的测吸光度Aj，和1mLDPPH+1mL水混合测吸光度Ac。
DPPH清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%
3.3对羟自由基清除率的测定：
参考文献[10-12]所述的方法，并做了适当调整。取浓度为0.75 mmol/L邻二氮菲1mL在试管中，并且按顺序加入pH值为7.4的磷酸缓冲液（PBS）2mL，样品溶液1ml，充分混匀，然后加入浓度为0.75 mol/L的硫酸亚铁1mL，混匀，加入0.03%双氧水1mL，37℃水浴1小时，于536nm处测其吸光度As；空白组用水代替双氧水，为Ab；损伤组用水代替样品，为Ap。
清除率（%）=[（As-Ap）/（Ab-Ap）]×100%
3.4对Fe2+离子的螯合作用：
将干净的具塞试管中分别依次加入不同质量浓度的受试样品（3mg/mL～20mg/mL）0.5mL， 20μM FeCl2溶液1 mL，混匀后加入0.5 mM ferrozine 1 mL，25℃反应20min后于562 nm处测定吸光度Ab[13]；空白组以水代替样品，为Ac。
螯合力（%）=（1-Ab/Ac）×100%
3.5还原能力的测定：参考文献 [14]并略有改动。将干净的具塞试管中分别依次加人样品1mL，另加入1mL Tris-HCl （0.2 mol/L，pH=6.6 ）及1%铁氰化钾2.5 mL，混匀后于50℃水浴20 min，然后加入10%三氯乙酸1.5 mL，混匀后3000 r/min离心10 min。精确移取上层清液2.0 mL，加入蒸馏水2.0 mL和0.1%三氯化铁0.5 mL，混匀后放置10min，于700 nm处测定吸光度值A，吸光度值越大表明还原力越强[15]。
4 结果与分析
4.1 正交实验结果：为了得到具有最佳抗氧化活性的碱性蛋白酶水解物，本实验以DPPH清除率为指标，进行4因素3水平L9（3）4的正交实验，结果见表1。
由表1可知，影响碱性蛋白酶水解物抗氧化活性的各因素排列順序为D>A>C>B，即pH值影响最大，水解时间影响最小；碱性蛋白酶水解物抗氧化性最强的水解条件为A3B1C3D1。因此，本实验选择的温度为50℃、时间4h、加酶量2000 u/g、pH9作为最佳水解条件。 4.2水解物对DPPH自由基的清除率：将最佳水解条件下得到的水解物冷冻干燥，检测样品浓度为1mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL时碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基的清除率。结果见图1所示，碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基的清除率随着浓度的升高而增大，当浓度为5mg/mL
时，清除率达到91.24%。
4.3 水解物对羟自由基清除率：同样设置5个浓度组，即2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，分别检测其对羟自由基的清除率。结果见图2所示，不同浓度的碱性蛋白酶水解物对羟自由基均有一定程度的清除作用，并且随着浓度升高，清除率增大，对羟自由基的清除率低于DPPH，当浓度为10 mg/mL时，清除率为74.84%。
4.5 水解物的还原能力：同樣设置6个浓度组，即1 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL 、20 mg/mL，分别检测其还原力。根据“3.5”还原力的测定方法，在700 nm处的吸光度越大，水解物的还原能力越强。结果见图4所示，在所设置的浓度范围内，随着浓度增大，还原力增强，即呈现浓度依赖性。
〖XCG34.TIF〗
图4 碱性蛋白酶水解物的还原力
5结论
本试验采用正交实验方法研究碱性蛋白酶对青蛤进行水解时各因素及水平对抗氧化活性的影响。结果显示，水解物抗氧化活性最大的影响因素为pH值，最小的影响因素为水解时间，且当温度为50℃、时间为4h、加酶量为2000 u/g、pH为9时，水解物的抗氧化活性最强。在最佳抗氧化水解条件下得到的水解水解物，对羟自由基、DPPH自由基、Fe2+离子的螯合作用均有一定的清除活性，且该水解物对自由基的清除率和还原力均呈现浓度依赖性。本试验研究表明：碱性蛋白酶对青蛤水解得到的水解物具有较好的抗氧化活性。这为青蛤酶解物的产业化开发提供科学的理论依据。
参考文献
[1] 王兴强，阎斌罗，董双林等.青蛤的生物学及其繁殖[J].水产科学，2006，25（6）：312-316.
[2] 曾庆祝，曾庆孝.海洋贝类 （牡蛎、扇贝、文蛤等）功能性食品的开发利用[J].氨基酸和生物资源， 2002（3）：31-341.
[3] 许庆陵，曾庆祝.鲢酶解物对羟自由基的清除作用[J].大连水产学院水产学报，2002， 28（1）： 93-991.
[4] 欧成坤，杨瑞金.牡蛎酶解产物的ACE抑制活性和清除自由基活性研究[J].食品工业科技，2005 （3） ： 59-621.
[5] 刘振学，黄仁和，田爱民.实验设计与数据处理[G].化学工业出版社，2001：63-70.
[6] 张尊昕，杨伯伦，刘谦光等.野葛根异黄酮成分的超声萃取及抗氧化作用[J].食品科学，2002，23（5）：31-33.
[7] YINRONG L U， YEAPFOO L. Antioxidant and radical scabengingactivities of polyphenols from apple pomace[J]. Food Chemistry， 2000，68： 81-85.
[8] EONG L P， SHUI G. An investigation of antioxidant capacity of fruits inSingapore markets[J]. Food Chemistry， 2002， 76： 69-75
[9] Brand W， Cuvelier ME & Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity [J]. LWT-Food Science and Technology， 1995， 28-25.
[10] 陈美珍，余杰，郭慧敏等.大豆分离蛋白酶解物清除羟基自由基的研究[J].食品科学，2002，23（1）：43-47.
[11] 杨宁，赵谋明，刘洋等.野生仙人掌多糖抗氧化性研究[J].食品科技，2007（2）：147-150.
[12] 王多宁，张小莉，杨颖等.百合多糖对羟自由基的清除作用[J].陕西中医学院学报，2006，29（4）：53-55.
[13] Gursoy N， Sarikurkcu C， Cengiz M， et al. Antioxidant activities， metal contents， total phenolics and flavonoids of seven Morchella species[J]. Food and Chemical Toxicology，2009，47（9）：2381.
[14] Song LY，Li TF，YuRM，et al.Antionxidant activities of hydrolysates of Arca subcrenata prepared with three proteases[J].Mar Drugs，2008，6（4）：607-619.
[15] Prieto P， Pineda M， Aguilar M. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex： specific application to the determination of vitamin E[J]. Analytical Biochemistry， 1999， 269（2）：337.