【摘 要】
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目的 运用多重核酸扩增(PCR)联合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)分析技术原理,针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以
【机 构】
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广东出入境检验检疫局,华南农业大学,广州市胸科医院
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目的 运用多重核酸扩增(PCR)联合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)分析技术原理,针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC快速检测方法,实现同时检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌.方法 根据四种分枝杆菌特异基因序列分别设计菌种特异核酸扩增引物,通过筛选优化试验建立四重核酸扩增体系,对核酸扩增产物采用DHPLC设备进行检测分析,每一菌种的核酸扩增产物分别形成DHPLC特征峰图.对结核分枝杆菌等51株分枝杆菌标准株和分离株样品以及沙门氏菌等22株常见微生物样品进行特异性检测试验;对四种分枝杆菌特异的核酸扩增产物分别制备克隆质粒,通过对梯度稀释的阳性质粒的检测试验,进行多重PCR-DHPLC灵敏度测试;对疑似病人痰液样品和疑似发病牛的组织样品进行检测,并与细菌分离培养法进行比较以验证临床检测效果. 结果该方法能快速检测鉴别上述四种分枝杆菌,检测灵敏度达到10~2～10~3基因拷贝,从131份疑似病人临床样品中检出91份结核分枝杆菌阳性,从40份来自疑似发病牛群的临床样品中检出31份牛分枝杆菌阳性,检出率均高于细菌分离培养法.结论 研究表明所建立的多重PCR-DHPLC方法能快速检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌,为人畜结核、副结核病诊断提供一种新型分子生物学技术手段.
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