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摘要目的：探討丹参酚酸B不同给药浓度和不同给药时间窗对缺氧损伤乳鼠心肌细胞TLR4NFκBTNFα炎性反应通路的调节作用。方法：分离纯化出生1～3 d Wistar乳鼠心肌细胞、建立体外缺氧细胞模型。丹参酚酸B（SalB）大、中、小剂量浓度分别为10-5 mol/L、10-6 mol/L和10-7 mol/L并按照缺氧前6 h、缺氧同时和缺氧后6 h 3种给药方式进行干预。qRTPCR法检测心肌细胞tool样受体4（TLR4）和核因子κB（NFκB）mRNA的表达，细胞爬片免疫组化法检测TLR4和NFκB蛋白的表达，ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α（TNFα）的浓度。结果：与正常组比较，缺氧模型组TLR4和NFκB mRNA和蛋白的表达量、细胞上清液中TNFα浓度均显著升高（P<005或P<001）。和缺氧模型组比较，丹参酚酸B预防给药和同时给药大、中剂量组TLR4和NFκB mRNA和蛋白的表达量、细胞上清液中TNFα的浓度均显著下降（P<005或P<001）。预防给药大剂量组下降最显著（P<001）。结论：TLR4NFκBTNFα炎性反应通路在缺氧损伤6 h即明显激活。SalB预防或同时干预对缺氧损伤的心肌细胞有明显的保护作用，该作用与抑制TLR4NFκBTNFα炎性反应损伤通路相关。SalB具有量效和时效性，以大剂量预防给药效果最佳。
关键词丹参酚酸B；缺氧损伤；乳鼠；心肌细胞；TLR4NFκBTNFα通路；量效；时效；缺血性心肌病
Study on the Dose and Time Effects of Salvianolic Acid B on TLR4NFκBTNFαpathway in Neonatal Rat Cardiomyocytes Damaged by Hypoxia
Zhang Yun1， Zhang Ting2， Guo Lili3， Liu Ruihua1， Wu GuangJun1， Zhang YingYing3
（1 Research Department of Immunology， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China； 2 Parmacology Department， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China； 3 Drug Research and Development Center， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）
AbstractObjective：To investigate the effects of different concentrations and different administration time of salvianolic acid B （SalB） on regulating TLR4NFκBTNFα inflammatory pathway in hypoxia neonatal rat cardiomyocytes. Methods：13 d neonatal cardiomyocytes were isolated and purified， and hypoxia model was established in vitro. SalB high， medium and low dose concentrations were 105 mol/L， 106 mol/L and 107 mol/L， and administered to cells at 6h before hypoxia， same time with hypoxia and 6h after hypoxia respectively. TLR4 and NFκB mRNA expression were detected by qRTPCR； TLR4 and NFκB protein expression were detected by immunohistochemical method. The concentration of supernatant TNFα was detected by ELISA. Results：Compared with normal group， the expression of TLR4 and NFκB mRNA and protein， the concentration of TNFαin supernatant were significantly increased in hypoxia model group （P<005 or P<001）. Compared with the hypoxia model group， the expression of TLR4 and NFκB mRNA and protein， the concentration of TNFα in supernatant were significantly decreased in large and middle dose of salvianolic acid B administered before and meantime of hypoxia group （P<005 or P<001）. The most significant decrease was observed in the highdose group administered before hypoxia （P<001）.Conclusion：TLR4NFκBTNFα inflammatory pathway was significantly activated 6h after hypoxia injury. Salvianolic acid B administered before and same time of hypoxia protected cardiomyocytes tremendously. This effect was related to the inhibition of TLR4NFκBTNFα inflammatory pathway. Salvianolic acid B showed dose and time related effects， and the best effect was observed in the highdose group administered before hypoxia. Key WordsSalvianolic acid B； hopoxia； neonatal rat； Cardiomyocytes； TLR4NFκBTNFα pathway； Dose effect； Time effect； Ischemic cardiomyopathy
中图分类号：R2855文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.10.048
Toll样受体4（TLR4）是一种跨膜信号转导受体，在免疫细胞、内皮细胞、心肌细胞、肝细胞和神经胶质细胞等表面广泛存在表达[12]。TLR4主要通过核转录因子（NFκB）诱导炎性反应递质和炎性反应因子的产生释放激活炎性反应的发生[34]。研究发现阿托伐他汀通过抑制TLR4和NFκB信号通路改善结肠炎大鼠的肠道炎性反应[5]。鱼腥草素钠显著抑制LPS刺激的牛乳腺上皮细胞TLR4的表达和NFκB的激活，且抑制TNFα、IL1β和IL6的产生[6]。我们前期的实验研究也发现，丹参酚酸B能显著抑制TLR4NFκBTNFα炎性反应通路，从而保护缺氧损伤和炎性反应损伤心肌细胞[78]。本文在前期工作基础上进一步深入研究SalB保护缺氧损伤心肌细胞的量效和时效关系。阐明SalB治疗缺血性疾病的作用机制并为临床合理用药提供科学依据。
1材料与方法
11材料
111细胞出生1～3 d SpragueDawley乳鼠购自北京维通利华实验动物中心，经中国中医科学院广安门医院伦理委员会批准用于实验研究。颈动脉放血处死后，立即用75%乙醇消毒皮肤开胸摘取心脏，留取心尖至心室部分，DHANKS液清洗后剪成1 mm3小块，每只心脏加入2 mL混合消化液进行多次消化，收集乳鼠心肌细胞。详细方法参照文献[78]。
112药物丹参酚酸B对照品（Salvianolic acid B）：购自四川先欣生化技术研究所，面积归一化法检测纯度为9890%，货号XXBSMI004。
113试剂与仪器低糖DMEM培养基：美国Hyclone产品，货号SH3002101B；DHANKS：TBD Science产品，货号HA2004Y；Ⅱ型胶原酶：Sigma公司产品，100 mg/支，货号C6885；025%胰酶：美国Hyclone产品，货号SH3004201；TLR4和NFκB引物（赛百盛生物技术公司合成）；Trizol 100 mL（Invitrogen，Cat No15596026，USA）；SYBR green PCR master Mix（ABI，Cat No4309155，UK）；反转录试剂盒（MBI，Cat NoK1622，USA）；兔抗大鼠TLR4和NFκB多克隆抗体（Santa Cruz，货号分别是：sc30002和sc33022）；TNFα ELISA检测试剂盒：美国RB公司产品，货号3R080。SANYO CO2培养箱；OLLYMPUS IX70型倒置显微镜；超净工作台；MULTISKAN MK3全自动多功能酶标仪（Thermo，USA）及缺氧培养装置。
12方法
121分组与模型制备心肌细胞共分为5组，分别为：正常组；缺氧模型组；SalB大剂量组；SalB中剂量组；SalB小剂量组。采用缺氧装置系统，将细胞置于充满95%N2密封装置内，采用无糖DHanks液代替DMEM培养基。血气分析表明常氧和缺氧细胞培养液中氧分压分别为200 mmHg和21 mmHg，达到所需要的缺氧条件。
122给药方法（或干预方法）SalB大、中、低剂量浓度分别为10-5 mol/L、10-6 mol/L和10-7 mol/L。预防给药是指SalB加入培养基后6 h再置于缺氧装置6 h后收集标本；同时给药是指SalB加入培养基后立即置于缺氧装置6 h后收集标本；后给药是指细胞置于缺氧装置6 h后加入SalB干预6 h再收集标本。
123检测指標与方法qRTPCR检测方法：冲洗刮取并离心收集心肌细胞，加入05 mL Trizol混合，按Trizol说明抽提总RNA。总RNA的反转录、引物设计和RTPCR的扩增条件都与前期的实验研究一致，具体内容参见文献[9]。免疫组化及ELISA法：免疫组化法检测爬片细胞TLR4和NFκB蛋白，ELISA法检测培养上清液中TNFα浓度，均严格按照说明书操作。
13统计学方法采用SPSS 190统计软件进行数据分析。各指标均为计量资料，用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey法，以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21丹参酚酸B调节缺氧心肌细胞TLR4 mRNA的量效和时效作用与正常组比较，缺氧各组心肌细胞TLR4 mRNA表达显著升高（P<001或P<005）。与缺氧组比较，丹参酚酸B预防给药大、中、小剂量组TLR4 mRNA表达均显著下降（P<001或P<005）。丹参酚酸B同时给药大、中剂量组TLR4 mRNA表达显著下降（P<005）。丹参酚酸B后给药各组TLR4 mRNA表达差异无统计学意义（P>005）。见表1。
3讨论
缺氧损伤是某些缺血性疾病的主要病理损伤因素，且伴随疾病的发生、发展和转归的全过程。如重要脏器心脑肾的缺血性疾病：冠心病、急性心肌梗死、脑梗死、肾动脉狭窄和肾动脉硬化等。缺氧诱导肾上皮细胞TLR4和NFκB的表达，引起细胞凋亡、炎性反应因子TNFα释放和肾小管间质纤维化。糖蛋白Slit2可以抑制TLR4和NFκB的表达减轻炎性反应和纤维化的发生[10]。缺氧的脂肪细胞TLR4受体表达上调88倍、NFκB信号激活、炎性反应因子释放。本研究发现缺氧损伤乳鼠心肌细胞在缺氧后6 h TLR4和NFκB mRNA和蛋白的表达均显著增加，细胞上清液中TNFα含量也显著升高[11]。据此，我们推断缺氧状态下TLR4NFκBTNFα炎性反应通路明显激活，是缺氧状态下炎性反应损伤的主要机制。 活血化瘀中药丹参被广泛应用于心脑血管疾病和糖尿病肾病等动脉粥样硬化的预防和治疗[1213]。丹参酚酸B是丹参中含量最丰富的生物活性化合物。SalB可呈剂量依赖性地降低缺血再灌注引起的神经功能损伤，治疗局灶性脑缺血再灌注损伤[14]。SalB还能增加缺血缺氧干细胞的存活率[15]。SalB对脑缺血再灌注的保护作用与抑制血小板活化和下调NFκB通路相关。我们课题组前期的研究工作发现，SalB能保护缺氧损伤和炎性反应损伤心肌细胞，其作用机制与抑制TLR4NFκBTNFα炎性反应通路相关[78]。但目前未见关于SalB对缺氧损伤心肌细胞保护作用的量效和时效关系研究报导。
本研究发现SalB对缺氧损伤乳鼠心肌细胞TLR4NFκBTNFα炎性反应通路的抑制作用存在明显的量效和时效关系。大、中剂量组较小剂量组效果显著。缺氧前预防给药和缺氧同时给药较缺氧后给药效果显著。因此，我们认为临床应用丹参酚酸B或丹参类制剂（如丹红注射液，丹七片、丹参滴丸等）治疗缺血性疾病宜早期、足量和全程给药为佳，以便更好地发挥其抗炎和保护缺氧损伤组织细胞的作用。
本研究是细胞实验，干扰混杂因素少，实验结果具有可靠性。今后还需要进一步进行动物实验和临床实验研究，需要考虑到病和证的对应和结合，丹参主要对应的是血瘀证。
参考文献
[1]ChienSung Tsai，ChunYao Huang，ChienHo Chen，et al.Eotaxin2 increased tolllike receptor 4 expression in endothelial cells in vitro and exacerbates highcholesterol dietinduced atherogenesis in vivo[J].Am J Transl Res，2016，8（12）：53385353.
[2]Huanzhang Shao，Cunzhen Wang，Wenliang Zhu，et al.Different regulation of Tolllike receptor 4 expression on blood CD14+ monocytes by simvastatin in patients with sepsis and severe sepsis[J].Int J Clin Exp Med，2015，8（8）：1383013835.
[3]Yanzhe Wang，Lei Li，Shumin Deng，Fang Liu，and Zhiyi He.Ursolic Acid Ameliorates Inflammation in Cerebral Ischemia and Reperfusion Injury Possibly via High Mobility Group Box 1/TollLike Receptor 4/NFκB Pathway[J].Front Neurol，2018，22（9）：253.
[4]Ferrandez E，Gutierrez O，Segundo DS，et al.NFκB activation in differentiating glioblastoma stemlike cells is promoted by hyaluronic acid signaling through TLR4[J].Sci Rep，2018，8（1）：63396341.
[5]Rashidian A，Muhammadnejad A，Dehpour AR，et al.Atorvastatin attenuates TNBSinduced rat colitis：the involvement of the TLR4/NFkB signaling pathway[J].Inflammopharmacology，2016，24（23）：109118.
[6]Wang W，Hu X，Shen P，et al.Sodium houttuyfonate inhibits LPSinduced inflammatory response via suppressing TLR4/NFκB signaling pathway in bovine mammary epithelial cells[J].Microb Pathog，2017，107（9）：1216.
[7]WANG Jie，ZHANG Yun，GUO Lili，et al.Salbianolic Acid B Inhibits the TLR4NFκBTNFαPathway and Attenuates Neonatal Rat Cardiomyocyte[J].Chinese Journal of Integrative Medicine，2011，17（10）：775780.
[8]张云，王阶，吴广均，等.丹参酚酸B抑制TLR4NFκBTNFα炎性反应损伤通路防治心肌细胞的缺氧损伤[J].中医杂志，2012，39（1）：2023.
[9]张云，王阶，郭丽丽，等.活血安心方减轻急性心肌梗死大鼠心肌缺血损伤的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2012，32（7）：939943.
[10]Zhou X，Yao Q，Sun X，et al.Slit2 ameliorates renal inflammation and fibrosis after hypoxiaand lipopolysaccharideinduced epithelial cells injury in vitro[J].Exp Cell Res，2017，352（1）：123129.
[11]Priyanka A，Sindhu G，Shyni GL，et al.Bilobalide abates inflammation，insulin resistance and secretion of angiogenic factors induced by hypoxia in 3T3L1 adipocytes by controlling NFκB and JNK activation[J].Int Immunopharmacol，2017，42（10）：209217.
[12]Kaihuan Wang，Dan Zhang，Jiarui Wu，et al.A comparative study of Danhong injection and Salvia miltiorrhiza injection in the treatment of cerebral infarction：A systematic review and metaanalysis[J].Medicine（Baltimore），2017，96（22）：e7079.
[13]JieMing Nie，HaiFeng Li.Therapeutic effects of Salvia miltiorrhiza injection combined with telmisartan in patients with diabetic nephropathy by influencing collagen IV and fibronectin：A casecontrol study[J].Exp Ther Med，2018，16（4）：34053412.
[14]Xu S，Zhong A，Ma H，et al.Neuroprotective effect of salvianolic acid B against cerebral ischemic injury in rats via the CD40/NFκB pathway associated with suppression of platelets activation and neuroinflammation[J].Brain Res，2017，166（1）：3748.
[15]Ran Kim，Seokyeon Lee，Chang Youn Lee，et al.Salvia miltiorrhiza enhances the survival of mesenchymal stem cells under ischemic conditions[J].J Pharm Pharmacol，2018，70（9）：12281241.
（2017-06-23收稿責任编辑：芮莉莉）
关键词丹参酚酸B；缺氧损伤；乳鼠；心肌细胞；TLR4NFκBTNFα通路；量效；时效；缺血性心肌病
Study on the Dose and Time Effects of Salvianolic Acid B on TLR4NFκBTNFαpathway in Neonatal Rat Cardiomyocytes Damaged by Hypoxia
Zhang Yun1， Zhang Ting2， Guo Lili3， Liu Ruihua1， Wu GuangJun1， Zhang YingYing3
（1 Research Department of Immunology， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China； 2 Parmacology Department， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China； 3 Drug Research and Development Center， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）
AbstractObjective：To investigate the effects of different concentrations and different administration time of salvianolic acid B （SalB） on regulating TLR4NFκBTNFα inflammatory pathway in hypoxia neonatal rat cardiomyocytes. Methods：13 d neonatal cardiomyocytes were isolated and purified， and hypoxia model was established in vitro. SalB high， medium and low dose concentrations were 105 mol/L， 106 mol/L and 107 mol/L， and administered to cells at 6h before hypoxia， same time with hypoxia and 6h after hypoxia respectively. TLR4 and NFκB mRNA expression were detected by qRTPCR； TLR4 and NFκB protein expression were detected by immunohistochemical method. The concentration of supernatant TNFα was detected by ELISA. Results：Compared with normal group， the expression of TLR4 and NFκB mRNA and protein， the concentration of TNFαin supernatant were significantly increased in hypoxia model group （P<005 or P<001）. Compared with the hypoxia model group， the expression of TLR4 and NFκB mRNA and protein， the concentration of TNFα in supernatant were significantly decreased in large and middle dose of salvianolic acid B administered before and meantime of hypoxia group （P<005 or P<001）. The most significant decrease was observed in the highdose group administered before hypoxia （P<001）.Conclusion：TLR4NFκBTNFα inflammatory pathway was significantly activated 6h after hypoxia injury. Salvianolic acid B administered before and same time of hypoxia protected cardiomyocytes tremendously. This effect was related to the inhibition of TLR4NFκBTNFα inflammatory pathway. Salvianolic acid B showed dose and time related effects， and the best effect was observed in the highdose group administered before hypoxia. Key WordsSalvianolic acid B； hopoxia； neonatal rat； Cardiomyocytes； TLR4NFκBTNFα pathway； Dose effect； Time effect； Ischemic cardiomyopathy
中图分类号：R2855文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.10.048
Toll样受体4（TLR4）是一种跨膜信号转导受体，在免疫细胞、内皮细胞、心肌细胞、肝细胞和神经胶质细胞等表面广泛存在表达[12]。TLR4主要通过核转录因子（NFκB）诱导炎性反应递质和炎性反应因子的产生释放激活炎性反应的发生[34]。研究发现阿托伐他汀通过抑制TLR4和NFκB信号通路改善结肠炎大鼠的肠道炎性反应[5]。鱼腥草素钠显著抑制LPS刺激的牛乳腺上皮细胞TLR4的表达和NFκB的激活，且抑制TNFα、IL1β和IL6的产生[6]。我们前期的实验研究也发现，丹参酚酸B能显著抑制TLR4NFκBTNFα炎性反应通路，从而保护缺氧损伤和炎性反应损伤心肌细胞[78]。本文在前期工作基础上进一步深入研究SalB保护缺氧损伤心肌细胞的量效和时效关系。阐明SalB治疗缺血性疾病的作用机制并为临床合理用药提供科学依据。
1材料与方法
11材料
111细胞出生1～3 d SpragueDawley乳鼠购自北京维通利华实验动物中心，经中国中医科学院广安门医院伦理委员会批准用于实验研究。颈动脉放血处死后，立即用75%乙醇消毒皮肤开胸摘取心脏，留取心尖至心室部分，DHANKS液清洗后剪成1 mm3小块，每只心脏加入2 mL混合消化液进行多次消化，收集乳鼠心肌细胞。详细方法参照文献[78]。
112药物丹参酚酸B对照品（Salvianolic acid B）：购自四川先欣生化技术研究所，面积归一化法检测纯度为9890%，货号XXBSMI004。
113试剂与仪器低糖DMEM培养基：美国Hyclone产品，货号SH3002101B；DHANKS：TBD Science产品，货号HA2004Y；Ⅱ型胶原酶：Sigma公司产品，100 mg/支，货号C6885；025%胰酶：美国Hyclone产品，货号SH3004201；TLR4和NFκB引物（赛百盛生物技术公司合成）；Trizol 100 mL（Invitrogen，Cat No15596026，USA）；SYBR green PCR master Mix（ABI，Cat No4309155，UK）；反转录试剂盒（MBI，Cat NoK1622，USA）；兔抗大鼠TLR4和NFκB多克隆抗体（Santa Cruz，货号分别是：sc30002和sc33022）；TNFα ELISA检测试剂盒：美国RB公司产品，货号3R080。SANYO CO2培养箱；OLLYMPUS IX70型倒置显微镜；超净工作台；MULTISKAN MK3全自动多功能酶标仪（Thermo，USA）及缺氧培养装置。
12方法
121分组与模型制备心肌细胞共分为5组，分别为：正常组；缺氧模型组；SalB大剂量组；SalB中剂量组；SalB小剂量组。采用缺氧装置系统，将细胞置于充满95%N2密封装置内，采用无糖DHanks液代替DMEM培养基。血气分析表明常氧和缺氧细胞培养液中氧分压分别为200 mmHg和21 mmHg，达到所需要的缺氧条件。
122给药方法（或干预方法）SalB大、中、低剂量浓度分别为10-5 mol/L、10-6 mol/L和10-7 mol/L。预防给药是指SalB加入培养基后6 h再置于缺氧装置6 h后收集标本；同时给药是指SalB加入培养基后立即置于缺氧装置6 h后收集标本；后给药是指细胞置于缺氧装置6 h后加入SalB干预6 h再收集标本。
123检测指標与方法qRTPCR检测方法：冲洗刮取并离心收集心肌细胞，加入05 mL Trizol混合，按Trizol说明抽提总RNA。总RNA的反转录、引物设计和RTPCR的扩增条件都与前期的实验研究一致，具体内容参见文献[9]。免疫组化及ELISA法：免疫组化法检测爬片细胞TLR4和NFκB蛋白，ELISA法检测培养上清液中TNFα浓度，均严格按照说明书操作。
13统计学方法采用SPSS 190统计软件进行数据分析。各指标均为计量资料，用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey法，以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21丹参酚酸B调节缺氧心肌细胞TLR4 mRNA的量效和时效作用与正常组比较，缺氧各组心肌细胞TLR4 mRNA表达显著升高（P<001或P<005）。与缺氧组比较，丹参酚酸B预防给药大、中、小剂量组TLR4 mRNA表达均显著下降（P<001或P<005）。丹参酚酸B同时给药大、中剂量组TLR4 mRNA表达显著下降（P<005）。丹参酚酸B后给药各组TLR4 mRNA表达差异无统计学意义（P>005）。见表1。
3讨论
缺氧损伤是某些缺血性疾病的主要病理损伤因素，且伴随疾病的发生、发展和转归的全过程。如重要脏器心脑肾的缺血性疾病：冠心病、急性心肌梗死、脑梗死、肾动脉狭窄和肾动脉硬化等。缺氧诱导肾上皮细胞TLR4和NFκB的表达，引起细胞凋亡、炎性反应因子TNFα释放和肾小管间质纤维化。糖蛋白Slit2可以抑制TLR4和NFκB的表达减轻炎性反应和纤维化的发生[10]。缺氧的脂肪细胞TLR4受体表达上调88倍、NFκB信号激活、炎性反应因子释放。本研究发现缺氧损伤乳鼠心肌细胞在缺氧后6 h TLR4和NFκB mRNA和蛋白的表达均显著增加，细胞上清液中TNFα含量也显著升高[11]。据此，我们推断缺氧状态下TLR4NFκBTNFα炎性反应通路明显激活，是缺氧状态下炎性反应损伤的主要机制。 活血化瘀中药丹参被广泛应用于心脑血管疾病和糖尿病肾病等动脉粥样硬化的预防和治疗[1213]。丹参酚酸B是丹参中含量最丰富的生物活性化合物。SalB可呈剂量依赖性地降低缺血再灌注引起的神经功能损伤，治疗局灶性脑缺血再灌注损伤[14]。SalB还能增加缺血缺氧干细胞的存活率[15]。SalB对脑缺血再灌注的保护作用与抑制血小板活化和下调NFκB通路相关。我们课题组前期的研究工作发现，SalB能保护缺氧损伤和炎性反应损伤心肌细胞，其作用机制与抑制TLR4NFκBTNFα炎性反应通路相关[78]。但目前未见关于SalB对缺氧损伤心肌细胞保护作用的量效和时效关系研究报导。
本研究发现SalB对缺氧损伤乳鼠心肌细胞TLR4NFκBTNFα炎性反应通路的抑制作用存在明显的量效和时效关系。大、中剂量组较小剂量组效果显著。缺氧前预防给药和缺氧同时给药较缺氧后给药效果显著。因此，我们认为临床应用丹参酚酸B或丹参类制剂（如丹红注射液，丹七片、丹参滴丸等）治疗缺血性疾病宜早期、足量和全程给药为佳，以便更好地发挥其抗炎和保护缺氧损伤组织细胞的作用。
本研究是细胞实验，干扰混杂因素少，实验结果具有可靠性。今后还需要进一步进行动物实验和临床实验研究，需要考虑到病和证的对应和结合，丹参主要对应的是血瘀证。
参考文献
[1]ChienSung Tsai，ChunYao Huang，ChienHo Chen，et al.Eotaxin2 increased tolllike receptor 4 expression in endothelial cells in vitro and exacerbates highcholesterol dietinduced atherogenesis in vivo[J].Am J Transl Res，2016，8（12）：53385353.
[2]Huanzhang Shao，Cunzhen Wang，Wenliang Zhu，et al.Different regulation of Tolllike receptor 4 expression on blood CD14+ monocytes by simvastatin in patients with sepsis and severe sepsis[J].Int J Clin Exp Med，2015，8（8）：1383013835.
[3]Yanzhe Wang，Lei Li，Shumin Deng，Fang Liu，and Zhiyi He.Ursolic Acid Ameliorates Inflammation in Cerebral Ischemia and Reperfusion Injury Possibly via High Mobility Group Box 1/TollLike Receptor 4/NFκB Pathway[J].Front Neurol，2018，22（9）：253.
[4]Ferrandez E，Gutierrez O，Segundo DS，et al.NFκB activation in differentiating glioblastoma stemlike cells is promoted by hyaluronic acid signaling through TLR4[J].Sci Rep，2018，8（1）：63396341.
[5]Rashidian A，Muhammadnejad A，Dehpour AR，et al.Atorvastatin attenuates TNBSinduced rat colitis：the involvement of the TLR4/NFkB signaling pathway[J].Inflammopharmacology，2016，24（23）：109118.
[6]Wang W，Hu X，Shen P，et al.Sodium houttuyfonate inhibits LPSinduced inflammatory response via suppressing TLR4/NFκB signaling pathway in bovine mammary epithelial cells[J].Microb Pathog，2017，107（9）：1216.
[7]WANG Jie，ZHANG Yun，GUO Lili，et al.Salbianolic Acid B Inhibits the TLR4NFκBTNFαPathway and Attenuates Neonatal Rat Cardiomyocyte[J].Chinese Journal of Integrative Medicine，2011，17（10）：775780.
[8]张云，王阶，吴广均，等.丹参酚酸B抑制TLR4NFκBTNFα炎性反应损伤通路防治心肌细胞的缺氧损伤[J].中医杂志，2012，39（1）：2023.
[9]张云，王阶，郭丽丽，等.活血安心方减轻急性心肌梗死大鼠心肌缺血损伤的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2012，32（7）：939943.
[10]Zhou X，Yao Q，Sun X，et al.Slit2 ameliorates renal inflammation and fibrosis after hypoxiaand lipopolysaccharideinduced epithelial cells injury in vitro[J].Exp Cell Res，2017，352（1）：123129.
[11]Priyanka A，Sindhu G，Shyni GL，et al.Bilobalide abates inflammation，insulin resistance and secretion of angiogenic factors induced by hypoxia in 3T3L1 adipocytes by controlling NFκB and JNK activation[J].Int Immunopharmacol，2017，42（10）：209217.
[12]Kaihuan Wang，Dan Zhang，Jiarui Wu，et al.A comparative study of Danhong injection and Salvia miltiorrhiza injection in the treatment of cerebral infarction：A systematic review and metaanalysis[J].Medicine（Baltimore），2017，96（22）：e7079.
[13]JieMing Nie，HaiFeng Li.Therapeutic effects of Salvia miltiorrhiza injection combined with telmisartan in patients with diabetic nephropathy by influencing collagen IV and fibronectin：A casecontrol study[J].Exp Ther Med，2018，16（4）：34053412.
[14]Xu S，Zhong A，Ma H，et al.Neuroprotective effect of salvianolic acid B against cerebral ischemic injury in rats via the CD40/NFκB pathway associated with suppression of platelets activation and neuroinflammation[J].Brain Res，2017，166（1）：3748.
[15]Ran Kim，Seokyeon Lee，Chang Youn Lee，et al.Salvia miltiorrhiza enhances the survival of mesenchymal stem cells under ischemic conditions[J].J Pharm Pharmacol，2018，70（9）：12281241.
（2017-06-23收稿責任编辑：芮莉莉）