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【摘 要】 笔者根据近年文献，总结马钱子及其制剂在药动力学相关方面的研究现状发现，马钱子及其制剂的生物样品处理常采用液液萃取法和固相萃取法；血药浓度测定常采用高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱法；多数实验表明马钱子及其制剂的体内药动学过程基本符合二房室模型。具有快吸收、快分布的特点；消除速度随实验方法和剂型不同有很大差异。但是马钱子及其制剂的药物动力学研究方法有待于规范与提高。复方制剂中的其他成分可能对药物在体内的药效学过程有影响，需要进行深入研究。
【关键词】 马钱子； 士的宁；马钱子碱；药动学
马钱子具有散血热、消肿散结以及止痛通络等功效，中医临床常用于治疗跌打损伤，骨折肿痛，风湿顽痹，麻木瘫痪，痈疽疮毒，咽喉肿痛等症[1]。马钱子主要有效成分为生物碱类，含量为2%～5%，其中主要是士的宁（stychnine）和马钱子碱（brucine），各占1%～1.4%[2]。马钱子碱和士的宁是目前公认的有效成分，也是毒性成分。这类成分分子量低，有很好的脂溶性，极易跨膜吸收产生疗效或毒副作用。马钱子的治疗剂量与中毒剂量较为相近 ，马钱子治疗剂量为0.3～0.6 g[1]（规定含士的宁为1.2%～2.2%），士的宁口服中毒剂量成人为5～10 mg，口服致死量为30 mg[2]。蔡宝昌等[3]采用大鼠静脉注射马钱子总碱，以经过处理的动物组织作为样品，用高效液相色谱法定时测定各组织中士的宁（S）、马钱子碱（B）、士的宁氮氧化物（SNO）和马钱子碱氮氧化物（BNO）的含量。結果表明：S、B、SNO和BNO在其中脑和脊髓中均有较多的分布。这几种成分总体上在组织中的含量有所不同，可能是由于S本身在生物碱中含量较高，因此S在各组织中的含量最高，其次为B、SNO和BNO，各组织含量的差异是否与本身含量存在一定的相关性有待进一步探究，但是随着代谢的变化，各组织中的含量的动态分布总体上符合先增后减的变化规律。S、B、SNO和BNO均可穿透血脑屏障，到达脑和脊髓。如何安全合理地使用马钱子及其制剂，以保证临床安全有效，是必须解决的问题。药代动力学是定量研究药物在生物体内吸收，分布，代谢和排泄等体内过程规律的学科。进行马钱子及其制剂在生物体内的药物动力学研究，掌握其在体内的吸收、分布、排泄及代谢的经时变化规律，对解决上述问题具有非常重要的指导意义。因此，马钱子及其制剂的药代动力学研究是近年来研究的一个热点。本文对马钱子及其制剂在药代动力学方面的研究方法及进展综述如下。
1 生物样品的处理方法
1.1 液液萃取法 （liquid-liquid extraction，LLE），
是目前较为常用的提取分离方法。研究表明，马钱子中的生物碱多数偏亲脂性，该类生物碱在乙醚、氯仿等有机溶剂中的溶解度比其在水相中的溶解度要大，而且血液中的内源性杂质大多数是属于水溶性物质且极性较大，所以采用适当的有机溶剂进行萃取即可达到亲脂性成分与水溶性成分的分离，进而达到去除大部分杂质的目的[4]。最后，对待测成分进行浓集后制成供试品，用仪器进行检测。在采用液液萃取法进行操作时有几个因素需要注意：①首先是萃取溶剂的选择，选择恰当的萃取溶剂，可以提高萃取效率，操作中一般选择能够对药物具有较好溶解度以及沸点低且与水不相互溶的溶剂。在马钱子生物碱的生物样品萃取过程中，常采用的溶剂一般是氯仿、乙醚、甲基叔丁基醚，其中生物碱中的氮键与氯仿所具有的氢键可产生一定的作用力，使生物碱易于溶解在氯仿，从而使生物碱从血浆中被萃取出来[5]。张婷等[6]在测定马钱子碱脂质体时，采用氯仿进行萃取，其中氯仿2.5 ml，经过涡旋、超声、静置、离心后收集下层液，上层液再加入氯仿5 ml，重复操作，最后合并两次提取液，在水浴上用氮气吹干，用流动相溶解后即得样品。②水相的pH值也是重要的参数之一，马钱子中的生物碱属于亲脂性的碱性药物，而一般生物样品中的内源性物质多为酸性成分，所以在碱性下用有机溶剂萃取时，内源性杂质不易被萃取出来。在马钱子碱的萃取过程中通常采用氨水、氢氧化钠碱化溶液，既可以使生物碱发生游离，又可调节溶液PH值。王琳等[7]测定兔血浆中的马钱子碱，用氢氧化钠碱化溶液，使马钱子碱游离，再用氯仿和甲醇混合液萃取，回收率大于80%，效果较好。与其他分离方法相比，液液萃取法具有操作简单，经济实用且可将萃取液蒸发，使组分富集等优点，但是其缺点在于个别溶剂容易产生乳化现象，使药物损失，从而导致回收率低，所以在生物样品处理方面一定要选择合适的有机溶剂进行萃取。
1.2 固相萃取法 随着高效液相色谱的应用，人们利用色谱法等理论，采用有不同填料的聚丙烯小柱进行生物样品制备。SPE的填料种类很多，大致可分为亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合硅胶）、亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）和离子交换型三类。这三类方法在马钱子的生物样品的处理方面均有应用，吴玉红等[8]采用紫外三阶导数光谱测定含量时，采用硅藻土提取生物样品中的马钱子碱，其生物样品处理方法是将检品与去离子水混合均匀，然后加入到装有适量硅藻土的层析柱中，用洗脱液进行洗脱后在水浴挥干，溶剂溶解后即得样品，实验取得了较为理想的结果。王朝虹等[9]在LC/MS/MS法测定全血中马钱子碱和士的宁的含量，使用OasisTMMAX固相萃取小柱对生物样品进行萃取，首先用磷酸酸化样品，然后用适量蒸馏水稀释，涡旋混合、高速离心后上清液过预先以1 ml甲醇和水活化的OasisTM MAX固相萃取小柱，相继用1 ml0.1 molHcl和1 ml甲醇淋洗杂质并弃去；然后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液减压蒸干，残渣用流动相溶解混合后测定，回收率在80%以上。固相萃取小柱不仅大大缩短了样品制备时间，所用样品量少，而且避免了乳化现象和便于自动化操作等优点。但是其有价格昂贵、批与批之间有差异、柱子易堵塞影响分离效果等缺点。
2 马钱子体内外药物分析的方法
2.1 薄层色谱法 杨群英等[10]测定家兔肝脏中士的宁的含量采用的是薄层扫描法，将其肝脏制成匀浆后加入士的宁标准溶液，用浓盐酸酸化，分离出酸水层后，残渣用稀盐酸洗涤NaOH调pH，用适量氯仿提取两次，挥去氯仿，得到提取液。吸取适量提取液，点于硅胶 GF254薄层板上，以适当的混合溶剂为展开剂，展开，扫描。测定波长254 nm， 参比波长350 nm，在此条件下测得的士的宁生物碱回收率可达60%。薄层色谱法操作简单、经济，可以对复方样品进行定性和定量分析，常用于马钱子体外分析。但是由于其测定结果受铺板的材料、薄层板的厚薄、展开剂以及展开距离等因素干扰而不准确，不能满足体内药动学的要求，已不再使用。
2.2 荧光分光光度法 荧光分析法是利用物质发射荧光的特性进行分析的光学分析方法，选择性较好，并可提供较多的荧光参数。但不足之处是干扰因素较多，必须严格控制实验条件。李晓天等[11]测定马钱子碱在小鼠体内的血药浓度时采用了荧光光谱法 。经过荧光分光光度计扫描，马钱子碱溶液其最大激发波长和发射波长分别为395 nm和450 nm，狭缝均为10 nm。然后依照测定光谱，生物样品处理以后进行检测。该方法目前应用较少，其中主要原因是马钱子碱和士的宁属于荧光猝灭剂，测定准确度受到影响具有一定的局限性。
2.3 高效液相色谱法 高效液相色谱法是马钱子体内和体外分析常用的检测方法。肖寒露等[12]采用HPLC分析方法同时测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁的浓度，大鼠血浆样品以石杉碱甲为内标，液液萃取法处理后用KromasilC18柱分离，以乙腈-0.0l molL-1庚烷磺酸钠与0.02 molL-1磷酸二氢钾等量混合后用10%磷酸调体系pH 2.8（2476）作流动相，检测波长264 nm。马钱子碱和士的宁在50～2000 μgml-1线性良好，马钱子碱和士的宁的最低检测限分别为11.25 μgml-1、
10.71 μgml-1。王朝虹等[13]在测定全血中马钱子碱和士的宁含量时采用的是高效液相法，其将样品用磷酸酸化，稀释、混合、离心后将上清液通过Oasis MCX固相萃取小柱，采用XTerraTMRP18色谱柱进行分离，流动相乙腈-10 mmolL-1碳酸氢铵（氨水调pH 10.5）（体积比为2872），等度洗脱；流速1.0 mLmin-1；检测波长254 nm；柱温30 ℃；自动进样器温度4 ℃。在该条件下马钱子碱和士的宁的线性范围为0.05～10 mgL-1，最小检出限为0.15 ng。柯雪红等[14]采用反相高效液相色谱法测定了血清中士的宁含量。精密吸取血清1mL，置离心管中，加入甲醇，旋涡振荡，离心，倾取全部上清液通过Oasis固相萃取小柱。色谱条件：Hypersil Division ODS C18柱，流动相为甲醇-水（7030），检测波长为254 nm。结果士的宁0.031～2.000 μgml-1的范围内线性关系良好，最小检测浓度为0.0l μgml-1。马钱子的服用剂量小，体内血药浓度中含量较少，需要较大的样品量，而且灵敏度较低，逐渐被灵敏度更高的测定方法所替代。
2.4 气相色谱-质谱法 伍爱明等[15]在测定毒鼠强和马钱子碱混合毒物时使用了GC/MS进行检测分析。GC条件中载气为高纯氦气，MS条件为EI源，实验得出394为马钱子碱的分子离子峰，379、83、55等为马钱子碱的主要碎片离子峰。但是马钱子碱和士的宁的气化性较差，导致分析灵敏度低，因此此方法并不多见。
2.5 高效液相色谱-质谱法 高效液相色谱-质谱法是灵敏度和选择性都比较高的方法，提高了定量测定的灵敏度和准确度，适于中药复方中的微量组分进行结构分析，满足体内药物分析研究中对灵敏度和准确度的要求，但是操作成本较高。王朝虹等[9]在测定血液中马钱子碱和士的宁含量时采用的是高效液相色谱质谱联用法，其将样品用磷酸酸化，稀释、混合、离心后将上清液通过OasisTM MCX固相萃取小柱，萃取得到的萃取液经过处理以后用高效液相色谱质谱联用法检测。在该条件下，人血中马钱子碱和士的宁的线性范围为
0.01～5.0 μgml-1，最小检出限为0.2 μgml-1。
陈小红等[16]应用高效液相色谱-质谱法同时测定尿液中士的宁、马钱子碱含量，样品经盐酸酸化后，用Waters Oasis MCX小柱净化、提取分离，然后采用电喷雾电离离子化的方式测定。其中士的宁
m/z：335[M+H]+，马钱子碱 m/z：395[M+H]+，
外标法定量。测定结果显示士的宁、马钱子碱在5～500 μgml-1的浓度范围内线性关系良好，士的宁、马钱子碱检出限分别为0.04 μgml-1和0.05 μgml-1。林滨等[17]应用LC/MS/MS测定人血浆中马钱子碱的含量，样品溶液加入内标物乌头碱溶液、氨水、乙醚，涡旋、离心处理以后取上清液过滤然后上Zorbax SB-C18柱，流动相为乙腈-0.2%甲酸溶液（6040），然后通过电喷雾离子源，正离子检测，采用多反应监测方式进行定量分析，检测离子分别为马钱子碱m/z395→324、263，内标m/z646→586、526。血浆中马钱子碱浓度在4～400 μgml-1范围内线性关系良好。
3 马钱子的药代动力学研究
目前，对于马钱子的药动学研究主要有两类研究方法，一类是血药浓度法，另一类是生物效应法。
3.1 血药浓度法 此方法是通过测定中药单味药或复方药中已知成分（有效成分或毒性成分）在体液（血液、尿液、唾液、泪液）或组织中不同时间的药物浓度，得到药物浓度-时间数据，确立动力学模型，得出动力学参数以及药物濃度-时间曲线。现研究文献报道主要是以马钱子中的纯成分如士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物或马钱子碱氮氧化物为研究对象，采用静脉注射或口服，测其血药浓度，计算药动学参数，建立药物动力学模型，分析确立其在动物体内的分布与消除过程。徐晓月等[5]在用反相高效液相色谱谱法测定马钱子砂烫炮制品中的士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化合物、马钱子碱氮氧化合物在大鼠静脉注射的血药浓度，吸收速率常数Kα分别为0.12min-1、0.27min-1、
0.12min-1、0.25min-1和消除速率常数Kβ分别为0.0030min-1、0.0018min-1、0.0025min-1、 0.0022min-1；T1/2α分别为8 min、4 min、6.2 min、
3.0 min和T1/2β分别为262 min、416 min、285 min、
342 min，曲线下面积AUC分别为57578 h·μg·L-1、35240 h·μg·L-1、93088 h·μg·L-1、177712 h·μg·L-1。
结果表明其在大鼠体内的代谢均符合二室模型。彭拓华等[18]对九分散中士的宁的胃肠吸收进行了动力学研究，通过测定小鼠灌胃肠中士的宁的残留量，拟合小鼠胃肠残留量-时间曲线，其分布速率常数Kα和消除速率常数Kβ分别为0.2704·min-1和0.02031·min-1；其分布相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β分别为0.3112·min-1和3.4121·min-1，曲线下面积AUC为15922.8423 min·μg·kg-1。结果表明其在小鼠体内胃肠残留量经时变化符合一室模型。血药浓度法能准确、精确、严谨地计算动力学参数，对临床用药有较好的指导作用。
3.2 生物效应法 该方法以药效为指标进行药代动力学研究，研究对象主要为有效成分或毒性不明、复杂、相互作用不明、体内作用机制不明或无合适含量测定方法的单味中药或复方中药，包括药物积累法和药理效应法。药物积累法即急性累计死亡率法，是在首次给药后不同时间点对多组动物按相同剂量重复给药，求出不同时间点药物体内存量的动态变化，计算动力学参数。刘雅敏等[19]采用药物累积法，以小鼠灌胃急性死亡率为指标，研究热痹清片的药代动力学，其吸收速率常数Kα和消除速率常数Kβ分别为2.2270·h-1和0.2031·h-1；
其分布相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β分别为0.3112·h-1和3.4121·h-1，曲线下面积AUC=28.3233 h·g·kg-1，揭示该复方制剂在小鼠体内的药动学特征基本符合二房室模型。刘玉娥等以小鼠灌胃急性死亡率为指标，对马钱子散口服后的毒性和毒效动力学进行了研究[20]，吸收速率常
数Kα和消除速率常数Kβ分别为6.1889·h-1和0.8973·h-1；其吸收相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β分别为0.11 h和0.78 h，AUC=114.5 h·mg·kg-1
揭示其体内毒效残留量的消除呈一级动力学过程并基本符合静注时的二级开放模型。此法求得的药动学参数为表观药动学参数，不能精确分析药物马钱子或复方中马钱子在体内的动力学过程。朱建伟等[21]
热板法探讨了小鼠腹腔注射复方马钱子碱的药效动力学规律，根据时效曲线进行房室拟合并计算药效动力学参数，吸收速率常数Kα=0.09477min-1，
吸收相半衰期T1/2α=7.3min-1；消除速率常数Kβ=0.00203min-1，消除相半衰期Tl/2β=341.4 min，
曲线下面积AUC=122424.5 min·mg·kg-1。揭示在体内药效强度的衰减基本符合一级动力学过程。药理效应法得到的结果与实际药动学参数可能不符，药效与药物浓度间常存在滞后效应，无法反映吸收过程，导致实验结果产生偏差，而且不能提供药物代谢、排泄等数据信息，已很少使用。
4 马钱子的药代动力学研究展望
目前马钱子及其制剂的药代动力学研究，为临床用药提供了有价值的借鉴。由于士的宁和马钱子碱在药材和制剂中含量很低，加之毒性大、临床使用剂量的限制，开展药动学研究的难点是如何进行生物样品中待检测成分的富集以及可供选择的高灵敏度分析方法等问题。
目前文献报道显示，马钱子的单体、药材、复方制剂在体内的药代动力学过程不太相同，马钱子中的士的宁和马钱子碱在生物体内过程特点为快吸收、快分布、快消除。在復方制剂中，士的宁和马钱子碱的分布与消除速度比单体有所减慢。不同剂型中的士的宁和马钱子碱的体内消除过程也有所差异，如马钱子碱脂质体家兔耳静脉单次给药符合三室模型，而游离马钱子碱溶液符合二室模型。马钱子碱脂质体的消除半衰期是同剂量游离马钱子碱溶液的6.6倍 [7]。马钱子碱免疫纳米微粒在体内代谢过程属于非房室模型，半衰期为15～17 h，显著长于马钱子碱半衰期7 h左右，提高了药物的生物利用度，降低药物不良反应发生率[22]。采用不同的研究方法、实验动物、给药方式，得到的药动学参数差异很大，马钱子及其制剂的药物动力学研究方法有待于规范与提高。复方制剂中的其他成分可能对药物在体内的药效学及药动学有影响，需要进行深入研究。
临床上马钱子及其制剂通常多剂量长时间用药，目前仅报道的是单剂量给药的药代动力学研究。其多剂量给药的体内研究，对指导临床安全用药及新制剂的开发更有意义。
5 参考文献
[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：47-48.
[2] 杨仓良，程方，高渌纹，等.毒剧中药古今用[M].北京：中国医药科技出版社，1991：313-319.
[3] 蔡宝昌，徐晓月，潘扬，等.马钱子生物碱在大鼠体内的组织分布[J].中国药理学通报，2004，20 （4）：421-424.
[4] 陈军，胡巍，蔡宝昌，等.马钱子碱在大鼠体内的药动学[J].中国药学杂志，2009，44（10）：778-780.
[5] 徐晓月，蔡宝昌，潘扬，等.马钱子生物碱在大鼠体内的药代动力学研究[J].药学学报，2003，38 （6）：458-461.
[6] 张婷，陈军，王玮，等.马钱子碱脂质体在大鼠体内的药物动力学研究[J].中华中医药学刊，2010，8 （1）：69-71.
[7] 王琳，蔡宝昌，杨欢.马钱子碱溶液和马钱子碱脂质体在家兔体内的药代动力学比较研究[J].南京中医药大学学报，2006，22（3）：165-167. [8] 吴玉红.硅藻土提取紫外导数光谱法测定血中马钱子碱[J].辽宁警专学报，2004，5（5）：45-46.
[9] 王朝虹，邢俊波，王志萍.LC/MS/MS法测定全血中马钱子碱和士的宁的含量[J].中国法医学杂志，2008，23（4）：226-228.
[10] 杨群英，付强，杨广德，等.盐酸沉淀蛋白法从家兔肝脏匀浆中提取士的宁生物碱的条件研究[J].西安医科大学学报（医学版），1989，10（1）：40-43.
[11] 李晓天，张丽容，王天奎，等.马钱子碱在小鼠体内的组织分布[J]. 中国临床药理学与治疗学，2006，11（3）：342-344.
[12] 肖寒露，陈军，蔡宝昌，等. HPLC同时测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁的浓度[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：26-29.
[13] 王朝虹，果德安，胡春华.反相高效液相色谱法测定全血中马钱子碱和士的宁的含量[J].色谱，2003，21（4）：382-384.
[14] 柯雪红，陈纪藩.固相萃取反相高效液相色谱法测定通痹灵人血清中士的宁浓度[J].广州中醫药大学学报，2003，20（3）：237-239.
[15] 伍爱明，蒋丕泉，郑绍军，等.毒鼠强和马钱子碱混合毒物的GC/MS检测分析[J].刑事技术，2009，34
（5）：53-54.
[16] 陈晓红 ，李小平，姚浔平.高效液相色谱-质谱联用同时测定尿液中4种生物碱[J].中国卫生检验杂志，2006，16 （6）：691-693.
[17] 林滨，王贤亲，林丹，等.人血浆中马钱子碱的LC-MS/MS法测定[J].中国医药工业杂质，2008，39 （3）：206-208.
[18] 彭拓华，谢丽，李锐，等.九分散中士的宁的胃肠吸收动力学研究[J].中药材，1998，21（12）：626-627.
[19] 刘雅敏，张黎莉，娄玉钤，等.药物累积法研究热痹清片的药物动力学[J].辽宁中医杂志，2006，33（9）：1171-1172.
[20] 刘玉娥，王菊英，于德宁，等.马钱子散的毒性和毒效动力学研究[J].山东中医杂志，2002，21（9）：554-556.
[21] 朱建伟，武继彪，李成韶，等.复方马钱子碱的镇痛作用及其药效动力学初步观察[J].中国中医药信息杂志，2005，12（9）：36-37.
[22] 秦建民，杨林，撒忠秋，等.马钱子碱免疫纳米微粒的研制及药代动力学特点[J].中国组织工程研究，2012，16（29）：5331-5335.
【关键词】 马钱子； 士的宁；马钱子碱；药动学
马钱子具有散血热、消肿散结以及止痛通络等功效，中医临床常用于治疗跌打损伤，骨折肿痛，风湿顽痹，麻木瘫痪，痈疽疮毒，咽喉肿痛等症[1]。马钱子主要有效成分为生物碱类，含量为2%～5%，其中主要是士的宁（stychnine）和马钱子碱（brucine），各占1%～1.4%[2]。马钱子碱和士的宁是目前公认的有效成分，也是毒性成分。这类成分分子量低，有很好的脂溶性，极易跨膜吸收产生疗效或毒副作用。马钱子的治疗剂量与中毒剂量较为相近 ，马钱子治疗剂量为0.3～0.6 g[1]（规定含士的宁为1.2%～2.2%），士的宁口服中毒剂量成人为5～10 mg，口服致死量为30 mg[2]。蔡宝昌等[3]采用大鼠静脉注射马钱子总碱，以经过处理的动物组织作为样品，用高效液相色谱法定时测定各组织中士的宁（S）、马钱子碱（B）、士的宁氮氧化物（SNO）和马钱子碱氮氧化物（BNO）的含量。結果表明：S、B、SNO和BNO在其中脑和脊髓中均有较多的分布。这几种成分总体上在组织中的含量有所不同，可能是由于S本身在生物碱中含量较高，因此S在各组织中的含量最高，其次为B、SNO和BNO，各组织含量的差异是否与本身含量存在一定的相关性有待进一步探究，但是随着代谢的变化，各组织中的含量的动态分布总体上符合先增后减的变化规律。S、B、SNO和BNO均可穿透血脑屏障，到达脑和脊髓。如何安全合理地使用马钱子及其制剂，以保证临床安全有效，是必须解决的问题。药代动力学是定量研究药物在生物体内吸收，分布，代谢和排泄等体内过程规律的学科。进行马钱子及其制剂在生物体内的药物动力学研究，掌握其在体内的吸收、分布、排泄及代谢的经时变化规律，对解决上述问题具有非常重要的指导意义。因此，马钱子及其制剂的药代动力学研究是近年来研究的一个热点。本文对马钱子及其制剂在药代动力学方面的研究方法及进展综述如下。
1 生物样品的处理方法
1.1 液液萃取法 （liquid-liquid extraction，LLE），
是目前较为常用的提取分离方法。研究表明，马钱子中的生物碱多数偏亲脂性，该类生物碱在乙醚、氯仿等有机溶剂中的溶解度比其在水相中的溶解度要大，而且血液中的内源性杂质大多数是属于水溶性物质且极性较大，所以采用适当的有机溶剂进行萃取即可达到亲脂性成分与水溶性成分的分离，进而达到去除大部分杂质的目的[4]。最后，对待测成分进行浓集后制成供试品，用仪器进行检测。在采用液液萃取法进行操作时有几个因素需要注意：①首先是萃取溶剂的选择，选择恰当的萃取溶剂，可以提高萃取效率，操作中一般选择能够对药物具有较好溶解度以及沸点低且与水不相互溶的溶剂。在马钱子生物碱的生物样品萃取过程中，常采用的溶剂一般是氯仿、乙醚、甲基叔丁基醚，其中生物碱中的氮键与氯仿所具有的氢键可产生一定的作用力，使生物碱易于溶解在氯仿，从而使生物碱从血浆中被萃取出来[5]。张婷等[6]在测定马钱子碱脂质体时，采用氯仿进行萃取，其中氯仿2.5 ml，经过涡旋、超声、静置、离心后收集下层液，上层液再加入氯仿5 ml，重复操作，最后合并两次提取液，在水浴上用氮气吹干，用流动相溶解后即得样品。②水相的pH值也是重要的参数之一，马钱子中的生物碱属于亲脂性的碱性药物，而一般生物样品中的内源性物质多为酸性成分，所以在碱性下用有机溶剂萃取时，内源性杂质不易被萃取出来。在马钱子碱的萃取过程中通常采用氨水、氢氧化钠碱化溶液，既可以使生物碱发生游离，又可调节溶液PH值。王琳等[7]测定兔血浆中的马钱子碱，用氢氧化钠碱化溶液，使马钱子碱游离，再用氯仿和甲醇混合液萃取，回收率大于80%，效果较好。与其他分离方法相比，液液萃取法具有操作简单，经济实用且可将萃取液蒸发，使组分富集等优点，但是其缺点在于个别溶剂容易产生乳化现象，使药物损失，从而导致回收率低，所以在生物样品处理方面一定要选择合适的有机溶剂进行萃取。
1.2 固相萃取法 随着高效液相色谱的应用，人们利用色谱法等理论，采用有不同填料的聚丙烯小柱进行生物样品制备。SPE的填料种类很多，大致可分为亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合硅胶）、亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）和离子交换型三类。这三类方法在马钱子的生物样品的处理方面均有应用，吴玉红等[8]采用紫外三阶导数光谱测定含量时，采用硅藻土提取生物样品中的马钱子碱，其生物样品处理方法是将检品与去离子水混合均匀，然后加入到装有适量硅藻土的层析柱中，用洗脱液进行洗脱后在水浴挥干，溶剂溶解后即得样品，实验取得了较为理想的结果。王朝虹等[9]在LC/MS/MS法测定全血中马钱子碱和士的宁的含量，使用OasisTMMAX固相萃取小柱对生物样品进行萃取，首先用磷酸酸化样品，然后用适量蒸馏水稀释，涡旋混合、高速离心后上清液过预先以1 ml甲醇和水活化的OasisTM MAX固相萃取小柱，相继用1 ml0.1 molHcl和1 ml甲醇淋洗杂质并弃去；然后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液减压蒸干，残渣用流动相溶解混合后测定，回收率在80%以上。固相萃取小柱不仅大大缩短了样品制备时间，所用样品量少，而且避免了乳化现象和便于自动化操作等优点。但是其有价格昂贵、批与批之间有差异、柱子易堵塞影响分离效果等缺点。
2 马钱子体内外药物分析的方法
2.1 薄层色谱法 杨群英等[10]测定家兔肝脏中士的宁的含量采用的是薄层扫描法，将其肝脏制成匀浆后加入士的宁标准溶液，用浓盐酸酸化，分离出酸水层后，残渣用稀盐酸洗涤NaOH调pH，用适量氯仿提取两次，挥去氯仿，得到提取液。吸取适量提取液，点于硅胶 GF254薄层板上，以适当的混合溶剂为展开剂，展开，扫描。测定波长254 nm， 参比波长350 nm，在此条件下测得的士的宁生物碱回收率可达60%。薄层色谱法操作简单、经济，可以对复方样品进行定性和定量分析，常用于马钱子体外分析。但是由于其测定结果受铺板的材料、薄层板的厚薄、展开剂以及展开距离等因素干扰而不准确，不能满足体内药动学的要求，已不再使用。
2.2 荧光分光光度法 荧光分析法是利用物质发射荧光的特性进行分析的光学分析方法，选择性较好，并可提供较多的荧光参数。但不足之处是干扰因素较多，必须严格控制实验条件。李晓天等[11]测定马钱子碱在小鼠体内的血药浓度时采用了荧光光谱法 。经过荧光分光光度计扫描，马钱子碱溶液其最大激发波长和发射波长分别为395 nm和450 nm，狭缝均为10 nm。然后依照测定光谱，生物样品处理以后进行检测。该方法目前应用较少，其中主要原因是马钱子碱和士的宁属于荧光猝灭剂，测定准确度受到影响具有一定的局限性。
2.3 高效液相色谱法 高效液相色谱法是马钱子体内和体外分析常用的检测方法。肖寒露等[12]采用HPLC分析方法同时测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁的浓度，大鼠血浆样品以石杉碱甲为内标，液液萃取法处理后用KromasilC18柱分离，以乙腈-0.0l molL-1庚烷磺酸钠与0.02 molL-1磷酸二氢钾等量混合后用10%磷酸调体系pH 2.8（2476）作流动相，检测波长264 nm。马钱子碱和士的宁在50～2000 μgml-1线性良好，马钱子碱和士的宁的最低检测限分别为11.25 μgml-1、
10.71 μgml-1。王朝虹等[13]在测定全血中马钱子碱和士的宁含量时采用的是高效液相法，其将样品用磷酸酸化，稀释、混合、离心后将上清液通过Oasis MCX固相萃取小柱，采用XTerraTMRP18色谱柱进行分离，流动相乙腈-10 mmolL-1碳酸氢铵（氨水调pH 10.5）（体积比为2872），等度洗脱；流速1.0 mLmin-1；检测波长254 nm；柱温30 ℃；自动进样器温度4 ℃。在该条件下马钱子碱和士的宁的线性范围为0.05～10 mgL-1，最小检出限为0.15 ng。柯雪红等[14]采用反相高效液相色谱法测定了血清中士的宁含量。精密吸取血清1mL，置离心管中，加入甲醇，旋涡振荡，离心，倾取全部上清液通过Oasis固相萃取小柱。色谱条件：Hypersil Division ODS C18柱，流动相为甲醇-水（7030），检测波长为254 nm。结果士的宁0.031～2.000 μgml-1的范围内线性关系良好，最小检测浓度为0.0l μgml-1。马钱子的服用剂量小，体内血药浓度中含量较少，需要较大的样品量，而且灵敏度较低，逐渐被灵敏度更高的测定方法所替代。
2.4 气相色谱-质谱法 伍爱明等[15]在测定毒鼠强和马钱子碱混合毒物时使用了GC/MS进行检测分析。GC条件中载气为高纯氦气，MS条件为EI源，实验得出394为马钱子碱的分子离子峰，379、83、55等为马钱子碱的主要碎片离子峰。但是马钱子碱和士的宁的气化性较差，导致分析灵敏度低，因此此方法并不多见。
2.5 高效液相色谱-质谱法 高效液相色谱-质谱法是灵敏度和选择性都比较高的方法，提高了定量测定的灵敏度和准确度，适于中药复方中的微量组分进行结构分析，满足体内药物分析研究中对灵敏度和准确度的要求，但是操作成本较高。王朝虹等[9]在测定血液中马钱子碱和士的宁含量时采用的是高效液相色谱质谱联用法，其将样品用磷酸酸化，稀释、混合、离心后将上清液通过OasisTM MCX固相萃取小柱，萃取得到的萃取液经过处理以后用高效液相色谱质谱联用法检测。在该条件下，人血中马钱子碱和士的宁的线性范围为
0.01～5.0 μgml-1，最小检出限为0.2 μgml-1。
陈小红等[16]应用高效液相色谱-质谱法同时测定尿液中士的宁、马钱子碱含量，样品经盐酸酸化后，用Waters Oasis MCX小柱净化、提取分离，然后采用电喷雾电离离子化的方式测定。其中士的宁
m/z：335[M+H]+，马钱子碱 m/z：395[M+H]+，
外标法定量。测定结果显示士的宁、马钱子碱在5～500 μgml-1的浓度范围内线性关系良好，士的宁、马钱子碱检出限分别为0.04 μgml-1和0.05 μgml-1。林滨等[17]应用LC/MS/MS测定人血浆中马钱子碱的含量，样品溶液加入内标物乌头碱溶液、氨水、乙醚，涡旋、离心处理以后取上清液过滤然后上Zorbax SB-C18柱，流动相为乙腈-0.2%甲酸溶液（6040），然后通过电喷雾离子源，正离子检测，采用多反应监测方式进行定量分析，检测离子分别为马钱子碱m/z395→324、263，内标m/z646→586、526。血浆中马钱子碱浓度在4～400 μgml-1范围内线性关系良好。
3 马钱子的药代动力学研究
目前，对于马钱子的药动学研究主要有两类研究方法，一类是血药浓度法，另一类是生物效应法。
3.1 血药浓度法 此方法是通过测定中药单味药或复方药中已知成分（有效成分或毒性成分）在体液（血液、尿液、唾液、泪液）或组织中不同时间的药物浓度，得到药物浓度-时间数据，确立动力学模型，得出动力学参数以及药物濃度-时间曲线。现研究文献报道主要是以马钱子中的纯成分如士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物或马钱子碱氮氧化物为研究对象，采用静脉注射或口服，测其血药浓度，计算药动学参数，建立药物动力学模型，分析确立其在动物体内的分布与消除过程。徐晓月等[5]在用反相高效液相色谱谱法测定马钱子砂烫炮制品中的士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化合物、马钱子碱氮氧化合物在大鼠静脉注射的血药浓度，吸收速率常数Kα分别为0.12min-1、0.27min-1、
0.12min-1、0.25min-1和消除速率常数Kβ分别为0.0030min-1、0.0018min-1、0.0025min-1、 0.0022min-1；T1/2α分别为8 min、4 min、6.2 min、
3.0 min和T1/2β分别为262 min、416 min、285 min、
342 min，曲线下面积AUC分别为57578 h·μg·L-1、35240 h·μg·L-1、93088 h·μg·L-1、177712 h·μg·L-1。
结果表明其在大鼠体内的代谢均符合二室模型。彭拓华等[18]对九分散中士的宁的胃肠吸收进行了动力学研究，通过测定小鼠灌胃肠中士的宁的残留量，拟合小鼠胃肠残留量-时间曲线，其分布速率常数Kα和消除速率常数Kβ分别为0.2704·min-1和0.02031·min-1；其分布相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β分别为0.3112·min-1和3.4121·min-1，曲线下面积AUC为15922.8423 min·μg·kg-1。结果表明其在小鼠体内胃肠残留量经时变化符合一室模型。血药浓度法能准确、精确、严谨地计算动力学参数，对临床用药有较好的指导作用。
3.2 生物效应法 该方法以药效为指标进行药代动力学研究，研究对象主要为有效成分或毒性不明、复杂、相互作用不明、体内作用机制不明或无合适含量测定方法的单味中药或复方中药，包括药物积累法和药理效应法。药物积累法即急性累计死亡率法，是在首次给药后不同时间点对多组动物按相同剂量重复给药，求出不同时间点药物体内存量的动态变化，计算动力学参数。刘雅敏等[19]采用药物累积法，以小鼠灌胃急性死亡率为指标，研究热痹清片的药代动力学，其吸收速率常数Kα和消除速率常数Kβ分别为2.2270·h-1和0.2031·h-1；
其分布相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β分别为0.3112·h-1和3.4121·h-1，曲线下面积AUC=28.3233 h·g·kg-1，揭示该复方制剂在小鼠体内的药动学特征基本符合二房室模型。刘玉娥等以小鼠灌胃急性死亡率为指标，对马钱子散口服后的毒性和毒效动力学进行了研究[20]，吸收速率常
数Kα和消除速率常数Kβ分别为6.1889·h-1和0.8973·h-1；其吸收相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β分别为0.11 h和0.78 h，AUC=114.5 h·mg·kg-1
揭示其体内毒效残留量的消除呈一级动力学过程并基本符合静注时的二级开放模型。此法求得的药动学参数为表观药动学参数，不能精确分析药物马钱子或复方中马钱子在体内的动力学过程。朱建伟等[21]
热板法探讨了小鼠腹腔注射复方马钱子碱的药效动力学规律，根据时效曲线进行房室拟合并计算药效动力学参数，吸收速率常数Kα=0.09477min-1，
吸收相半衰期T1/2α=7.3min-1；消除速率常数Kβ=0.00203min-1，消除相半衰期Tl/2β=341.4 min，
曲线下面积AUC=122424.5 min·mg·kg-1。揭示在体内药效强度的衰减基本符合一级动力学过程。药理效应法得到的结果与实际药动学参数可能不符，药效与药物浓度间常存在滞后效应，无法反映吸收过程，导致实验结果产生偏差，而且不能提供药物代谢、排泄等数据信息，已很少使用。
4 马钱子的药代动力学研究展望
目前马钱子及其制剂的药代动力学研究，为临床用药提供了有价值的借鉴。由于士的宁和马钱子碱在药材和制剂中含量很低，加之毒性大、临床使用剂量的限制，开展药动学研究的难点是如何进行生物样品中待检测成分的富集以及可供选择的高灵敏度分析方法等问题。
目前文献报道显示，马钱子的单体、药材、复方制剂在体内的药代动力学过程不太相同，马钱子中的士的宁和马钱子碱在生物体内过程特点为快吸收、快分布、快消除。在復方制剂中，士的宁和马钱子碱的分布与消除速度比单体有所减慢。不同剂型中的士的宁和马钱子碱的体内消除过程也有所差异，如马钱子碱脂质体家兔耳静脉单次给药符合三室模型，而游离马钱子碱溶液符合二室模型。马钱子碱脂质体的消除半衰期是同剂量游离马钱子碱溶液的6.6倍 [7]。马钱子碱免疫纳米微粒在体内代谢过程属于非房室模型，半衰期为15～17 h，显著长于马钱子碱半衰期7 h左右，提高了药物的生物利用度，降低药物不良反应发生率[22]。采用不同的研究方法、实验动物、给药方式，得到的药动学参数差异很大，马钱子及其制剂的药物动力学研究方法有待于规范与提高。复方制剂中的其他成分可能对药物在体内的药效学及药动学有影响，需要进行深入研究。
临床上马钱子及其制剂通常多剂量长时间用药，目前仅报道的是单剂量给药的药代动力学研究。其多剂量给药的体内研究，对指导临床安全用药及新制剂的开发更有意义。
5 参考文献
[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：47-48.
[2] 杨仓良，程方，高渌纹，等.毒剧中药古今用[M].北京：中国医药科技出版社，1991：313-319.
[3] 蔡宝昌，徐晓月，潘扬，等.马钱子生物碱在大鼠体内的组织分布[J].中国药理学通报，2004，20 （4）：421-424.
[4] 陈军，胡巍，蔡宝昌，等.马钱子碱在大鼠体内的药动学[J].中国药学杂志，2009，44（10）：778-780.
[5] 徐晓月，蔡宝昌，潘扬，等.马钱子生物碱在大鼠体内的药代动力学研究[J].药学学报，2003，38 （6）：458-461.
[6] 张婷，陈军，王玮，等.马钱子碱脂质体在大鼠体内的药物动力学研究[J].中华中医药学刊，2010，8 （1）：69-71.
[7] 王琳，蔡宝昌，杨欢.马钱子碱溶液和马钱子碱脂质体在家兔体内的药代动力学比较研究[J].南京中医药大学学报，2006，22（3）：165-167. [8] 吴玉红.硅藻土提取紫外导数光谱法测定血中马钱子碱[J].辽宁警专学报，2004，5（5）：45-46.
[9] 王朝虹，邢俊波，王志萍.LC/MS/MS法测定全血中马钱子碱和士的宁的含量[J].中国法医学杂志，2008，23（4）：226-228.
[10] 杨群英，付强，杨广德，等.盐酸沉淀蛋白法从家兔肝脏匀浆中提取士的宁生物碱的条件研究[J].西安医科大学学报（医学版），1989，10（1）：40-43.
[11] 李晓天，张丽容，王天奎，等.马钱子碱在小鼠体内的组织分布[J]. 中国临床药理学与治疗学，2006，11（3）：342-344.
[12] 肖寒露，陈军，蔡宝昌，等. HPLC同时测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁的浓度[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：26-29.
[13] 王朝虹，果德安，胡春华.反相高效液相色谱法测定全血中马钱子碱和士的宁的含量[J].色谱，2003，21（4）：382-384.
[14] 柯雪红，陈纪藩.固相萃取反相高效液相色谱法测定通痹灵人血清中士的宁浓度[J].广州中醫药大学学报，2003，20（3）：237-239.
[15] 伍爱明，蒋丕泉，郑绍军，等.毒鼠强和马钱子碱混合毒物的GC/MS检测分析[J].刑事技术，2009，34
（5）：53-54.
[16] 陈晓红 ，李小平，姚浔平.高效液相色谱-质谱联用同时测定尿液中4种生物碱[J].中国卫生检验杂志，2006，16 （6）：691-693.
[17] 林滨，王贤亲，林丹，等.人血浆中马钱子碱的LC-MS/MS法测定[J].中国医药工业杂质，2008，39 （3）：206-208.
[18] 彭拓华，谢丽，李锐，等.九分散中士的宁的胃肠吸收动力学研究[J].中药材，1998，21（12）：626-627.
[19] 刘雅敏，张黎莉，娄玉钤，等.药物累积法研究热痹清片的药物动力学[J].辽宁中医杂志，2006，33（9）：1171-1172.
[20] 刘玉娥，王菊英，于德宁，等.马钱子散的毒性和毒效动力学研究[J].山东中医杂志，2002，21（9）：554-556.
[21] 朱建伟，武继彪，李成韶，等.复方马钱子碱的镇痛作用及其药效动力学初步观察[J].中国中医药信息杂志，2005，12（9）：36-37.
[22] 秦建民，杨林，撒忠秋，等.马钱子碱免疫纳米微粒的研制及药代动力学特点[J].中国组织工程研究，2012，16（29）：5331-5335.