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摘要：本研究从5种市售泡菜中分离出11株具有乳酸菌特征的菌株，并进行编号，经过氧化氢酶接触试验、革兰氏染色后显微镜观察等进行筛选，初步鉴定为乳酸菌。然后对筛选出的菌株进行淀粉酶及纤维素酶活性试验等生理生化特性试验。并将菌株进行保藏，为进一步研究乳酸菌的生理及功能特性奠定基础。
关键词：泡菜；乳酸菌；分离；生理特性
中国是传统的泡菜生产国，泡菜种类繁多，国内在面已经做了大量的工作，分离筛选出了许多生产性能优良的菌种，如植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、干酪乳杆菌、弯曲乳杆菌。短乳杆菌、嗜酸乳杆菌等[1]。乳酸菌主要是一类能发酵碳水化合物且产乳酸的细菌的统称，迄今为止，已命名的乳酸菌起码有27个属，含有超过三百种。乳酸菌的特点：革兰氏染色阳性、活动性较差或无活动性、兼性厌氧，或厌氧，乳酸是主要的或唯一的发酵产物，15℃～45℃是最佳的生长温度，有良好的耐酸性，在pH<5时生长状况依然很好[2-4]。
本研究中，根据乳酸菌的形态学特征和生理生化特征，对本地区所收集的各种泡菜中乳酸菌的分离，并进行生理特性研究，为进一步的相关研究提供基础。
1实验方法
1.1改良MRS培养基的配制[5]
1.2泡菜样品处理
称取10 g泡菜，加无菌水稀释10倍，榨汁机打碎处理。
1.3菌株培养
把得到的泡菜汁进行梯度稀释，分别取10-3、10-5和10-6浓度的泡菜汁用涂布平板法接种到添加5% CaCO3的改良MRS培养基上，置于30 ℃培养箱里，倒置培养48 h后观察。
1.4观察计数
将产生白色钙圈的平板上菌落进行计数；
观察菌落的形态并根据形态特点区分出不同菌株。
1.5分离纯化
从平板挑选出形态不一致、长势良好且有明显透明钙圈的菌落在未接种的培养基上采取平板划线法培养，并将菌株编号记录。
在第二次划线的培养基上挑取单菌落作如下实验操作：革兰氏染色、过氧化氢酶接触实验、显微镜观察、培养基培养。
从第一次液体培养的菌液中取菌再次进行液体培养，再将液体培养后的菌进行保藏，以供后期需要。
1.6过氧化氢酶试验
从二次划线分离培养的培养基上挑取试验菌单菌落涂于滴有一滴3%H202溶液的载玻片上，如有气泡产生是阳性反应，没有气泡产生则为阴性反应。并将过氧化氢阴性的菌作为进一步实验菌株。
1.7革兰氏染色
在干净的载玻片上滴一滴无菌水，从二次划线的平板上挑去适量单菌落，均匀涂抹开，然后用酒精灯火焰烘干以杀死菌株并固定。用革兰氏染液进行染色，在100倍油镜下进行观察，被染成紫色或蓝紫色的为革兰氏阳性菌，红色或粉红色的为革兰氏阴性菌。
1.8菌液pH的测定
取二次液体培养后的试验菌，每株一管，用pB-10型pH计测定菌液pH。
1.9酶特性试验
淀粉酶特性：在改良MRS培养基基础上按2 g/L的比例加入可溶性淀粉，再加入2%琼脂制成固体平板，点接种菌种，30℃培养48 h，长出菌落后，加卢戈氏碘液染色，使染液均匀地铺于平板上，观察菌落周围有透明圈的为阳性反应，有淀粉酶活性，是淀粉酶产生菌。
纤维素酶特性：改良MRS基础培养基中分别加入1%羧甲基纤维素和2%琼脂制成固体平板，点接种菌液，37℃培养2-4 d。待菌落长成后，把0.1%刚果红染液均匀地铺在平板上染色，如果菌落的周围出现透明圈，则为阳性反应，有纤维素酶活性，是纤维素酶产生菌。
1.10 菌种的保藏
取500 μl经121℃灭菌15 min的50%甘油于EP管中，再取等量菌悬液，混匀后编号，置于-80℃冰箱中保藏。每株菌保藏3管。
2结果与分析
2.1菌落总数
每种泡菜样品培养后的具体菌落数及所分得的乳酸菌株数。
通过不断分离纯化，从5种泡菜样品中初步筛选出11株乳酸菌。不同菌株乳酸菌的数量如表2.1所示。散装泡菜分离出的乳酸菌株数较多，菌种组成也较为复杂。分析原因可知，散装泡菜大多为卖家自主自然发酵而成，其菌株的产生受原材料及当地的环境中微生物的影响，菌种较为丰富多样。
2.2菌落形态学观察结果
通过观察发现，各菌株菌落多呈圆形，只有少数呈不规则形。菌落的表面多数也是光滑的，只有2菌具有不光滑的表面。多数菌落边缘整齐，少数菌株边缘不整齐呈不规则形状。另外，经前期步骤挑选，所得菌落均具有明顯的钙圈。
2.3过氧化氢酶接触试验及革兰氏染色结果
通过氧化氢酶试验和革兰氏染色筛选后，所得试验菌株均为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阴性菌。显微镜下观察可见所有菌株都无芽孢存在，菌体多成球状，部分菌株有成串现象存在。
2.4 菌液pH测定结果
菌株进行第二次液体培养后，测定菌液的pH绝大多数集中在4.0～4.5之间。平均值为4.04，说明菌株产酸性较好。
2.5 酶活性试验结果
酶活性试验结果表明，11株菌中有10株菌有淀粉酶活性，9株菌有纤维素酶活性。具有淀粉酶活性的乳酸菌能水解淀粉，一般能直接利用淀粉产生乳酸，简化了乳酸生产中传统的淀粉两步发酵法。而纤维素酶能够降解天然纤维素，能够使大量纤维素资源以及城市纤维素废料变成人类所需物质。
3结论
实验从5种泡菜样品中培养、分离并筛选出了11株菌株。进行菌落形态学观察。计数菌落总数，记录菌落形态，并根据透明圈生成情况以及菌落形态差异进一步筛选了实验菌株。挑取了各菌株的单菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察菌体形态以球状居多。测定了菌液的pH，多在3.5～4.5之间，菌株产酸性较好，也为功能性试验提供了基础。对菌株进行过氧化氢酶接触试验，多数菌株呈过氧化氢酶阴性。进一步进行了淀粉酶及纤维素酶活性试验等生理生化特性研究，最后将初步鉴定的乳酸菌菌株进行了保藏，为进一步相关功能性研究等奠定基础。
参考文献：
[1]张刚.乳酸细菌技术和应用[M]. 化学工业出版社， 2007， 52-54.
[2]彭木，傅文端.乳酸菌的研究现状及展望[J]. 黑龙江农业科学， 2012， （12）： 132-136.
[3]何扩，张秀媛等.泡菜优质乳酸菌的筛选及其产酸性能鉴定[J].中国调味品， 2002（7）：37-39.
[4]栾金水.乳酸菌的研究应用进展[J]. 江苏调味副食品， 2010 （1）： 33-36.
[5]宋萍，陈功，王柱.绿色功能菌群发酵制泡菜的中试研究[J]. 四川食品与发酵， 2004， 40（3）： 16-21.
作者简介：
孙家财（1981-）男，汉族，山东牟平人，职称：助教，学历：硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏工程。
孙海峰（1981-）女，汉族，山东广饶人，职称：讲师，学历：硕士研究生，研究方向：果蔬加工。
关键词：泡菜；乳酸菌；分离；生理特性
中国是传统的泡菜生产国，泡菜种类繁多，国内在面已经做了大量的工作，分离筛选出了许多生产性能优良的菌种，如植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、干酪乳杆菌、弯曲乳杆菌。短乳杆菌、嗜酸乳杆菌等[1]。乳酸菌主要是一类能发酵碳水化合物且产乳酸的细菌的统称，迄今为止，已命名的乳酸菌起码有27个属，含有超过三百种。乳酸菌的特点：革兰氏染色阳性、活动性较差或无活动性、兼性厌氧，或厌氧，乳酸是主要的或唯一的发酵产物，15℃～45℃是最佳的生长温度，有良好的耐酸性，在pH<5时生长状况依然很好[2-4]。
本研究中，根据乳酸菌的形态学特征和生理生化特征，对本地区所收集的各种泡菜中乳酸菌的分离，并进行生理特性研究，为进一步的相关研究提供基础。
1实验方法
1.1改良MRS培养基的配制[5]
1.2泡菜样品处理
称取10 g泡菜，加无菌水稀释10倍，榨汁机打碎处理。
1.3菌株培养
把得到的泡菜汁进行梯度稀释，分别取10-3、10-5和10-6浓度的泡菜汁用涂布平板法接种到添加5% CaCO3的改良MRS培养基上，置于30 ℃培养箱里，倒置培养48 h后观察。
1.4观察计数
将产生白色钙圈的平板上菌落进行计数；
观察菌落的形态并根据形态特点区分出不同菌株。
1.5分离纯化
从平板挑选出形态不一致、长势良好且有明显透明钙圈的菌落在未接种的培养基上采取平板划线法培养，并将菌株编号记录。
在第二次划线的培养基上挑取单菌落作如下实验操作：革兰氏染色、过氧化氢酶接触实验、显微镜观察、培养基培养。
从第一次液体培养的菌液中取菌再次进行液体培养，再将液体培养后的菌进行保藏，以供后期需要。
1.6过氧化氢酶试验
从二次划线分离培养的培养基上挑取试验菌单菌落涂于滴有一滴3%H202溶液的载玻片上，如有气泡产生是阳性反应，没有气泡产生则为阴性反应。并将过氧化氢阴性的菌作为进一步实验菌株。
1.7革兰氏染色
在干净的载玻片上滴一滴无菌水，从二次划线的平板上挑去适量单菌落，均匀涂抹开，然后用酒精灯火焰烘干以杀死菌株并固定。用革兰氏染液进行染色，在100倍油镜下进行观察，被染成紫色或蓝紫色的为革兰氏阳性菌，红色或粉红色的为革兰氏阴性菌。
1.8菌液pH的测定
取二次液体培养后的试验菌，每株一管，用pB-10型pH计测定菌液pH。
1.9酶特性试验
淀粉酶特性：在改良MRS培养基基础上按2 g/L的比例加入可溶性淀粉，再加入2%琼脂制成固体平板，点接种菌种，30℃培养48 h，长出菌落后，加卢戈氏碘液染色，使染液均匀地铺于平板上，观察菌落周围有透明圈的为阳性反应，有淀粉酶活性，是淀粉酶产生菌。
纤维素酶特性：改良MRS基础培养基中分别加入1%羧甲基纤维素和2%琼脂制成固体平板，点接种菌液，37℃培养2-4 d。待菌落长成后，把0.1%刚果红染液均匀地铺在平板上染色，如果菌落的周围出现透明圈，则为阳性反应，有纤维素酶活性，是纤维素酶产生菌。
1.10 菌种的保藏
取500 μl经121℃灭菌15 min的50%甘油于EP管中，再取等量菌悬液，混匀后编号，置于-80℃冰箱中保藏。每株菌保藏3管。
2结果与分析
2.1菌落总数
每种泡菜样品培养后的具体菌落数及所分得的乳酸菌株数。
通过不断分离纯化，从5种泡菜样品中初步筛选出11株乳酸菌。不同菌株乳酸菌的数量如表2.1所示。散装泡菜分离出的乳酸菌株数较多，菌种组成也较为复杂。分析原因可知，散装泡菜大多为卖家自主自然发酵而成，其菌株的产生受原材料及当地的环境中微生物的影响，菌种较为丰富多样。
2.2菌落形态学观察结果
通过观察发现，各菌株菌落多呈圆形，只有少数呈不规则形。菌落的表面多数也是光滑的，只有2菌具有不光滑的表面。多数菌落边缘整齐，少数菌株边缘不整齐呈不规则形状。另外，经前期步骤挑选，所得菌落均具有明顯的钙圈。
2.3过氧化氢酶接触试验及革兰氏染色结果
通过氧化氢酶试验和革兰氏染色筛选后，所得试验菌株均为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阴性菌。显微镜下观察可见所有菌株都无芽孢存在，菌体多成球状，部分菌株有成串现象存在。
2.4 菌液pH测定结果
菌株进行第二次液体培养后，测定菌液的pH绝大多数集中在4.0～4.5之间。平均值为4.04，说明菌株产酸性较好。
2.5 酶活性试验结果
酶活性试验结果表明，11株菌中有10株菌有淀粉酶活性，9株菌有纤维素酶活性。具有淀粉酶活性的乳酸菌能水解淀粉，一般能直接利用淀粉产生乳酸，简化了乳酸生产中传统的淀粉两步发酵法。而纤维素酶能够降解天然纤维素，能够使大量纤维素资源以及城市纤维素废料变成人类所需物质。
3结论
实验从5种泡菜样品中培养、分离并筛选出了11株菌株。进行菌落形态学观察。计数菌落总数，记录菌落形态，并根据透明圈生成情况以及菌落形态差异进一步筛选了实验菌株。挑取了各菌株的单菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察菌体形态以球状居多。测定了菌液的pH，多在3.5～4.5之间，菌株产酸性较好，也为功能性试验提供了基础。对菌株进行过氧化氢酶接触试验，多数菌株呈过氧化氢酶阴性。进一步进行了淀粉酶及纤维素酶活性试验等生理生化特性研究，最后将初步鉴定的乳酸菌菌株进行了保藏，为进一步相关功能性研究等奠定基础。
参考文献：
[1]张刚.乳酸细菌技术和应用[M]. 化学工业出版社， 2007， 52-54.
[2]彭木，傅文端.乳酸菌的研究现状及展望[J]. 黑龙江农业科学， 2012， （12）： 132-136.
[3]何扩，张秀媛等.泡菜优质乳酸菌的筛选及其产酸性能鉴定[J].中国调味品， 2002（7）：37-39.
[4]栾金水.乳酸菌的研究应用进展[J]. 江苏调味副食品， 2010 （1）： 33-36.
[5]宋萍，陈功，王柱.绿色功能菌群发酵制泡菜的中试研究[J]. 四川食品与发酵， 2004， 40（3）： 16-21.
作者简介：
孙家财（1981-）男，汉族，山东牟平人，职称：助教，学历：硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏工程。
孙海峰（1981-）女，汉族，山东广饶人，职称：讲师，学历：硕士研究生，研究方向：果蔬加工。