论文部分内容阅读
摘要 [目的]建立高效SSR分子标记检测技术体系，加快抗稻瘟病育种进程，并为促进、推广SSR分子标记辅助选择技术在企业育种科研上的应用提供方法。[方法]采用田间叶片快速DNA提取技术、抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2连锁标记MRG4766和AP22的两重PCR技术及两道聚丙烯酰胺凝膠电泳技术，对抗稻瘟病育种群体
进行高效分子标记辅助选择。[结果]建立了一种成本低、操作简单、能够对抗稻瘟病双基因Pi-1和Pi-2进行准确、稳定、快捷、规模化檢测的方法。[结论]该技术体系可对抗稻瘟病育种群体进行高效分子标记辅助选择，加快抗稻瘟病育种进程，为SSR分子标记辅助选择技术在企业育种科研上的广泛应用提供了借鉴方法。
关键词 分子标记辅助选择；抗稻瘟病；DNA快速提取；两重PCR
中图分类号 S503.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）18-0115-03
Abstract [Objective] Exploring highefficient detection technology system of SSR molecular markers，to accelerate the process of rice blast resistance breeding and provide a new way of promoting and popularizing the markerassistant selection technology in enterprise field.[Method] The DNAs of leaves in field were extracted by rapid method，twofold PCR and twoline polyacrylamide gel electrophoresis with primers MRG4766 and AP22 were used to select breeding population.[Result] An technology system with less cost and simple operation was set up to fast detect rice blast resistant genes Pi1 and Pi2 accurately and stably on a large scale.[Conclusion] By the technology system，highefficient markerassistant selection to the blast resistant breeding population can be achieved to quicken the breeding process，and then popularize markerassistant selection technology in enterprise field.
Key words Markerassistant selection；Rice blast resistance；DNA fast extraction；Twofold PCR
稻瘟病是全球性的毁灭性水稻病害之一，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失为 11%～30%，给粮食安全造成隐患[1-2]。但由于稻瘟病菌小种的遗传复杂性及易变性，推广品种稻瘟病抗性周期短已经成为水稻生产的主要障碍之一，通过分子标记辅助选择（Markerassisted selection，MAS）技术，将多个抗病基因聚合到一个水稻品种中，培育具有广谱、持久抗性的水稻新品种，以延长品种的抗病周期，是当前有效的措施之一[3-5]。
来源于西非粳稻品种 LAC23 的 Pi-1和哥伦比亚籼稻品种 5173 的Pi-2 基因是2个显性广谱高抗稻瘟病基因[6-7]。LIU等[8]、陈志伟等[9]分别发展了与Pi-1连锁的SSR 标记RM144和 MRG4766，遗传距离分别为6.8 cm和1.3 cm；WU等[10]开发了与 Pi-2 紧密连锁的 SSR 标记 AP22，遗传距离为1.3 cm。这些以 PCR 为基础、操作简便、多态性丰富的 SSR 标记开发，为Pi-1和Pi-2 基因的分子标记辅助选择提供了理想的条件。然而，常规的分子标记检测程序复杂，效率低，成本相对较高，难以大范围、规模化地运用到商业化育种程序中去，因而在国内中小种子企业育种科研上的推广应用力度还较小。
笔者摸索、建立了一种在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种过程中，能够对抗稻瘟病双基因Pi-1和Pi-2进行准确、稳定、快捷、规模化检测的方法，以期加快抗稻瘟病育种进程，并促进SSR分子标记辅助选择技术在水稻育种科研上的推广应用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。用于抗稻瘟病分子标记辅助育种的供体材料同时含有抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2，编号为RBR1-2，由安徽农业大学陈庆全教授提供，受体材料为合肥丰乐种业股份有限公司提供的优质不育系广占63S或恢复系R2106。通过回交育种技术手段培育抗稻瘟病的不育系广占63S或恢复系R2106，并检测每个杂交及回交世代育种群体的抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的基因型。
1.1.2 主要试剂。引物购自上海生工生物工程技术服务中心；DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；磁珠法DNA提取试剂盒购自长春志昂生物科技公司；NaOH、Tris等化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 主要仪器。MyCler PCR仪由美国伯乐公司生产，Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析仪由美国热电公司生产，DYCZ-20C垂直电泳槽由北京六一公司生产。 1.2 方法
1.2.1 抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2连锁标记在供体与受体亲本间的多态性分析。利用磁珠法试剂盒提取抗稻瘟病基因供体材料RBR1-2，以及受体材料广占63s和R2106的基因组DNA；分别用连锁标记MRG4766和AP22检测抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的标记基因型及其多态性。
1.2.2 育种群体高效分子標记检测。
1.2.2.1 DNA快速提取及质量检测。每个单株的叶片取1.0 cm×1.0 cm大小的样品，放入96孔PCR管中，加入0.2 mol/L的NaOH溶液40 μL，在沸水中煮2 min，然后加入0.2 mol/L Tris-HCl溶液60 μL，在沸水中煮沸2 min后置冰上冷却，取1 μL提取液供PCR扩增反应或4 ℃下保存。用Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度及质量，随后比较磁珠法提取DNA与快提法提取DNA在随机选择的12个SSR标记位点上扩增谱带。
1.2.2.2 两重PCR扩增。采用10 μL的PCR反应体系，即在PCR反应管中分别加入样品DNA提取液（1.0 μL）、10×Buffer（1.0 μL）、dNTP（0.9 μL）、Pi-1检测引物MRG4766（0.5 μL），Pi-2检测引物AP22（0.5 μL）、ddH2O（6.0 μL）和Taq酶（0.1 μL）；PCR反应程序为：先94 ℃预变性2 min；再94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循环；72 ℃延伸5 min。反应完成后，加入6×Loading Buffer 终止反应，置4 ℃环境下保存备用。
1.2.2.3 产物两道电泳检测。扩增产物采用4%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，使用100孔密型点样梳一次性点样96孔PCR板上的96个样品；在2 000 V、85 W条件下，电泳15 min后，点样另外96个样品；继续电泳25 min后，染色、显影。
2 结果与分析
2.1 抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2连锁标记在供体与受体亲本间的多态性分析结果 由图1a、b可知，磁珠法提取的亲本DNA浓度在20～30 ng/μL，质量较高，OD260/OD280在2.0左右，满足PCR扩增要求；抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的供体与受体在连锁标记MRG4766和AP22上的扩增谱带清晰，且具有多态性（图2，每个品种3个重复），说明MRG4766和AP22可用于抗稻瘟病分子标记辅助育种。
2.2 育种群体快速DNA提取模板浓度及质量检测结果 快速法提取的基因组DNA的质量（OD260/OD280<1.8）低于磁珠法提取DNA的质量，但其浓度与磁珠法提取DNA浓度差异较小，且其在10对SSR引物上的扩增谱带清晰，与磁珠法提取DNA的扩增效果相比，除略浅之外，扩增结果一致（图3），说明快速法提取的DNA质量及浓度满足一般PCR扩增要求。
2.3 育种群体在Pi-1和Pi-2连锁标记上基因型分析结果 快速法提取96×2=192个样品的DNA后，经过两重PCR和两道聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，谱带清晰、易判读，且基因型分离情况与育种群体世代相吻合，结果准确可靠。图4为育种群体BC3F3世代6个株系（K133、K134、K135、K156、K157、K158）在MRG4766和AP22上的电泳图谱，结果表明，K133株系未导入供体抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2；K134株系未导入抗稻瘟病基因Pi-1，但在Pi-2基因型分离；K135株系基本未导入Pi-2，但在Pi-1基因型分离；K156、K157、K158这3个株系在Pi-1、Pi-2均基因型分离；此外，也存在纯合导入供体抗稻瘟病基因Pi-1或/和Pi-2的株系。
3 结论与讨论
常规的SSR分子标记检测程序中，DNA提取通常采用简易CTAB法或SDS法，过程复杂，费时费力，即使采用磁珠法或柱式法等试剂盒法提取DNA，也同样需要提前进行样品研磨，成本相对较高，而效率较低；此外，一般的单重PCR和单道聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖电泳，检测大样本多位点的效率也很低。因此，对于大的育种群体而言，采用常规SSR分子标记检测技术，其标记基因型的检测耗时长，成本也相对较高，因而难以大范围、规模化地运用于商业化的育种程序中，尤其难以推广应用于国内中小种子企业的育种科研中。
该文研究了育种群体田间叶片快速DNA提取技术，以及抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2连锁标记MRG4766和AP22的两重PCR及两道聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，结果表明，采用该技术体系提高了检测效率、降低了成本，且检测结果准确可靠，能在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种过程中，对抗稻瘟病双基因Pi-1和Pi-2进行准确、稳定、快捷、规模化的检测。应用该技术体系，经过3年的分子标记辅助回交育种，成功改良了合肥丰乐种业股份有限公司不育系广占63S和恢复系R2106的稻瘟病抗性，且不需要每个世代均进行稻瘟病抗性鉴定，从而加快了该公司抗稻瘟病育种进程，并显著降低了成本。总之，该技术体系为促进、推广SSR分子标记辅助选择技术在企业育种科研上的应用提供了一个新方法。
参考文献
[1] 赵二生，玉洪昊，张波.水稻稻瘟病抗病性育种研究进展[J].农业科技通讯，2012（8）：18-20.
[2] 何秀英，廖耀平，陈钊明，等.水稻稻瘟病抗病育种研究进展与展望[J].广东农业科学，2011，38（1）：30-33.
[3] 佚名.日本抗稻瘟病育种[J].上海农业科技，1978（S3）：46-51.
[4] 伍尚忠，朱小源，刘斌，等.籼稻品种三黄占2号的稻瘟病持久抗性评价与遗传分析[J].中国农业科学，2004，37（4）：528-534.
[5] 郭震华，刘传雪，张兰民，等.分子标记辅助选择在水稻抗稻瘟病育种中的研究进展[J].黑龙江农业科学，2013（2）：135-139.
[6] YU Z H，MACKILL D J，BONMAN J M，et al.Molecular mapping of genes for resistance to rice blast （Pyricularia grisea Sacc.）[J].Theor Appl Genet，1996，93（5）：859-863.
[7] YU Z H，MACKILL D J，BONMAN J M，et al.Tagging genes for blast resistance in rice via linkage to RFLP markers[J]. Theor Appl Genet，1991，81（4）：471-476.
[8] LIU S P，LI X，WANG Z Y et al.Improvement of resistance to rice blast in Zhenshan 97 by molecular markeraided selection[J].Acta Bot Sin，2003，45（11）：1346-1350.
[9] 陈志伟，官华忠，吴为人，等.稻瘟病抗性基因Pi-1连锁SSR标记的筛选和应用[J].福建农林大学学报（自然科学版），2005，34（1）：74-77.
[10] WU J H，JIANG J S，CHEN H L，et al. Fine mapping of rice blast resistance gene Pi-2（t）[J].Acta Agron Sin，2002，28（4）：505-509.
进行高效分子标记辅助选择。[结果]建立了一种成本低、操作简单、能够对抗稻瘟病双基因Pi-1和Pi-2进行准确、稳定、快捷、规模化檢测的方法。[结论]该技术体系可对抗稻瘟病育种群体进行高效分子标记辅助选择，加快抗稻瘟病育种进程，为SSR分子标记辅助选择技术在企业育种科研上的广泛应用提供了借鉴方法。
关键词 分子标记辅助选择；抗稻瘟病；DNA快速提取；两重PCR
中图分类号 S503.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）18-0115-03
Abstract [Objective] Exploring highefficient detection technology system of SSR molecular markers，to accelerate the process of rice blast resistance breeding and provide a new way of promoting and popularizing the markerassistant selection technology in enterprise field.[Method] The DNAs of leaves in field were extracted by rapid method，twofold PCR and twoline polyacrylamide gel electrophoresis with primers MRG4766 and AP22 were used to select breeding population.[Result] An technology system with less cost and simple operation was set up to fast detect rice blast resistant genes Pi1 and Pi2 accurately and stably on a large scale.[Conclusion] By the technology system，highefficient markerassistant selection to the blast resistant breeding population can be achieved to quicken the breeding process，and then popularize markerassistant selection technology in enterprise field.
Key words Markerassistant selection；Rice blast resistance；DNA fast extraction；Twofold PCR
稻瘟病是全球性的毁灭性水稻病害之一，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失为 11%～30%，给粮食安全造成隐患[1-2]。但由于稻瘟病菌小种的遗传复杂性及易变性，推广品种稻瘟病抗性周期短已经成为水稻生产的主要障碍之一，通过分子标记辅助选择（Markerassisted selection，MAS）技术，将多个抗病基因聚合到一个水稻品种中，培育具有广谱、持久抗性的水稻新品种，以延长品种的抗病周期，是当前有效的措施之一[3-5]。
来源于西非粳稻品种 LAC23 的 Pi-1和哥伦比亚籼稻品种 5173 的Pi-2 基因是2个显性广谱高抗稻瘟病基因[6-7]。LIU等[8]、陈志伟等[9]分别发展了与Pi-1连锁的SSR 标记RM144和 MRG4766，遗传距离分别为6.8 cm和1.3 cm；WU等[10]开发了与 Pi-2 紧密连锁的 SSR 标记 AP22，遗传距离为1.3 cm。这些以 PCR 为基础、操作简便、多态性丰富的 SSR 标记开发，为Pi-1和Pi-2 基因的分子标记辅助选择提供了理想的条件。然而，常规的分子标记检测程序复杂，效率低，成本相对较高，难以大范围、规模化地运用到商业化育种程序中去，因而在国内中小种子企业育种科研上的推广应用力度还较小。
笔者摸索、建立了一种在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种过程中，能够对抗稻瘟病双基因Pi-1和Pi-2进行准确、稳定、快捷、规模化检测的方法，以期加快抗稻瘟病育种进程，并促进SSR分子标记辅助选择技术在水稻育种科研上的推广应用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。用于抗稻瘟病分子标记辅助育种的供体材料同时含有抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2，编号为RBR1-2，由安徽农业大学陈庆全教授提供，受体材料为合肥丰乐种业股份有限公司提供的优质不育系广占63S或恢复系R2106。通过回交育种技术手段培育抗稻瘟病的不育系广占63S或恢复系R2106，并检测每个杂交及回交世代育种群体的抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的基因型。
1.1.2 主要试剂。引物购自上海生工生物工程技术服务中心；DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；磁珠法DNA提取试剂盒购自长春志昂生物科技公司；NaOH、Tris等化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 主要仪器。MyCler PCR仪由美国伯乐公司生产，Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析仪由美国热电公司生产，DYCZ-20C垂直电泳槽由北京六一公司生产。 1.2 方法
1.2.1 抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2连锁标记在供体与受体亲本间的多态性分析。利用磁珠法试剂盒提取抗稻瘟病基因供体材料RBR1-2，以及受体材料广占63s和R2106的基因组DNA；分别用连锁标记MRG4766和AP22检测抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的标记基因型及其多态性。
1.2.2 育种群体高效分子標记检测。
1.2.2.1 DNA快速提取及质量检测。每个单株的叶片取1.0 cm×1.0 cm大小的样品，放入96孔PCR管中，加入0.2 mol/L的NaOH溶液40 μL，在沸水中煮2 min，然后加入0.2 mol/L Tris-HCl溶液60 μL，在沸水中煮沸2 min后置冰上冷却，取1 μL提取液供PCR扩增反应或4 ℃下保存。用Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度及质量，随后比较磁珠法提取DNA与快提法提取DNA在随机选择的12个SSR标记位点上扩增谱带。
1.2.2.2 两重PCR扩增。采用10 μL的PCR反应体系，即在PCR反应管中分别加入样品DNA提取液（1.0 μL）、10×Buffer（1.0 μL）、dNTP（0.9 μL）、Pi-1检测引物MRG4766（0.5 μL），Pi-2检测引物AP22（0.5 μL）、ddH2O（6.0 μL）和Taq酶（0.1 μL）；PCR反应程序为：先94 ℃预变性2 min；再94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循环；72 ℃延伸5 min。反应完成后，加入6×Loading Buffer 终止反应，置4 ℃环境下保存备用。
1.2.2.3 产物两道电泳检测。扩增产物采用4%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，使用100孔密型点样梳一次性点样96孔PCR板上的96个样品；在2 000 V、85 W条件下，电泳15 min后，点样另外96个样品；继续电泳25 min后，染色、显影。
2 结果与分析
2.1 抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2连锁标记在供体与受体亲本间的多态性分析结果 由图1a、b可知，磁珠法提取的亲本DNA浓度在20～30 ng/μL，质量较高，OD260/OD280在2.0左右，满足PCR扩增要求；抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的供体与受体在连锁标记MRG4766和AP22上的扩增谱带清晰，且具有多态性（图2，每个品种3个重复），说明MRG4766和AP22可用于抗稻瘟病分子标记辅助育种。
2.2 育种群体快速DNA提取模板浓度及质量检测结果 快速法提取的基因组DNA的质量（OD260/OD280<1.8）低于磁珠法提取DNA的质量，但其浓度与磁珠法提取DNA浓度差异较小，且其在10对SSR引物上的扩增谱带清晰，与磁珠法提取DNA的扩增效果相比，除略浅之外，扩增结果一致（图3），说明快速法提取的DNA质量及浓度满足一般PCR扩增要求。
2.3 育种群体在Pi-1和Pi-2连锁标记上基因型分析结果 快速法提取96×2=192个样品的DNA后，经过两重PCR和两道聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，谱带清晰、易判读，且基因型分离情况与育种群体世代相吻合，结果准确可靠。图4为育种群体BC3F3世代6个株系（K133、K134、K135、K156、K157、K158）在MRG4766和AP22上的电泳图谱，结果表明，K133株系未导入供体抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2；K134株系未导入抗稻瘟病基因Pi-1，但在Pi-2基因型分离；K135株系基本未导入Pi-2，但在Pi-1基因型分离；K156、K157、K158这3个株系在Pi-1、Pi-2均基因型分离；此外，也存在纯合导入供体抗稻瘟病基因Pi-1或/和Pi-2的株系。
3 结论与讨论
常规的SSR分子标记检测程序中，DNA提取通常采用简易CTAB法或SDS法，过程复杂，费时费力，即使采用磁珠法或柱式法等试剂盒法提取DNA，也同样需要提前进行样品研磨，成本相对较高，而效率较低；此外，一般的单重PCR和单道聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖电泳，检测大样本多位点的效率也很低。因此，对于大的育种群体而言，采用常规SSR分子标记检测技术，其标记基因型的检测耗时长，成本也相对较高，因而难以大范围、规模化地运用于商业化的育种程序中，尤其难以推广应用于国内中小种子企业的育种科研中。
该文研究了育种群体田间叶片快速DNA提取技术，以及抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2连锁标记MRG4766和AP22的两重PCR及两道聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，结果表明，采用该技术体系提高了检测效率、降低了成本，且检测结果准确可靠，能在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种过程中，对抗稻瘟病双基因Pi-1和Pi-2进行准确、稳定、快捷、规模化的检测。应用该技术体系，经过3年的分子标记辅助回交育种，成功改良了合肥丰乐种业股份有限公司不育系广占63S和恢复系R2106的稻瘟病抗性，且不需要每个世代均进行稻瘟病抗性鉴定，从而加快了该公司抗稻瘟病育种进程，并显著降低了成本。总之，该技术体系为促进、推广SSR分子标记辅助选择技术在企业育种科研上的应用提供了一个新方法。
参考文献
[1] 赵二生，玉洪昊，张波.水稻稻瘟病抗病性育种研究进展[J].农业科技通讯，2012（8）：18-20.
[2] 何秀英，廖耀平，陈钊明，等.水稻稻瘟病抗病育种研究进展与展望[J].广东农业科学，2011，38（1）：30-33.
[3] 佚名.日本抗稻瘟病育种[J].上海农业科技，1978（S3）：46-51.
[4] 伍尚忠，朱小源，刘斌，等.籼稻品种三黄占2号的稻瘟病持久抗性评价与遗传分析[J].中国农业科学，2004，37（4）：528-534.
[5] 郭震华，刘传雪，张兰民，等.分子标记辅助选择在水稻抗稻瘟病育种中的研究进展[J].黑龙江农业科学，2013（2）：135-139.
[6] YU Z H，MACKILL D J，BONMAN J M，et al.Molecular mapping of genes for resistance to rice blast （Pyricularia grisea Sacc.）[J].Theor Appl Genet，1996，93（5）：859-863.
[7] YU Z H，MACKILL D J，BONMAN J M，et al.Tagging genes for blast resistance in rice via linkage to RFLP markers[J]. Theor Appl Genet，1991，81（4）：471-476.
[8] LIU S P，LI X，WANG Z Y et al.Improvement of resistance to rice blast in Zhenshan 97 by molecular markeraided selection[J].Acta Bot Sin，2003，45（11）：1346-1350.
[9] 陈志伟，官华忠，吴为人，等.稻瘟病抗性基因Pi-1连锁SSR标记的筛选和应用[J].福建农林大学学报（自然科学版），2005，34（1）：74-77.
[10] WU J H，JIANG J S，CHEN H L，et al. Fine mapping of rice blast resistance gene Pi-2（t）[J].Acta Agron Sin，2002，28（4）：505-509.