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摘要：葱属蔬菜作物（洋葱、大葱、大蒜和韭菜等）各组织部位富含多糖等次生代谢物质，严重影响了RNA的提取质量。本研究以洋葱叶片为样本，对多种RNA提取方法进行了比较分析，获得了一套适合葱属蔬菜作物RNA提取的系统方法。该方法将CTAB-GT连用、蛋白酶K替代DEPC和冰浴电泳检测相结合，其所提取的RNA样本产量约为152.35 μg/gFW，RNA完整性RIN值约为7.5，条带清晰，无多糖、蛋白质和DNA残留，28S约为18S两倍，提取过程安全无强致癌物质DEPC，可满足下游RNA分子实验的要求。且该方法适合于大葱、洋葱、大蒜和韭菜不同组织部位样本RNA的提取。
关键词：葱属蔬菜；RNA提取；多糖；CTAB-GT
中图分类号：S633+Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）09-0006-05
AbstractAllium vegetables （including Allium cepa， Allium fistulosum L. var. giganteum Makion， Allium sativum and Allium tuberosum Rottl. ex Spreng） are rich in polysaccharides and other secondary metabolites， which seriously affect the quality of extracted RNA. In this study， we compared and analyzed a variety of RNA extraction methods using onion leaves as samples， and obtained a set of method for RNA extraction from Allium vegetables. This method was comprised of CTAB-GT， Proteinase K instead of DEPC and ice bath gel electrophoresis. The yield of RNA samples was about 152.35 μg/gFW， the RNA integrity （RIN value） was about 7.5， the bands of gel electrophoresis were clear without contaminations of polysaccharides， protein and DNA residues， the ratio of 28S/18S was about 2 and the extraction process was safe without strong carcinogen of DEPC. The RNA quality was suitable for downstream molecular experiments. Besides， this method could be applied to the extractions of different tissues of welsh onion， onion， garlic and Chinese chives.
KeywordsAllium vegetables； RNA extraction； Polysaccharides； CTAB-GT
洋葱、大葱、大蒜和韭菜在APGⅢ分类系统中均为天门冬目石蒜科葱亚科葱属蔬菜作物，广泛种植于世界各地。它们不仅是人们餐桌上必备的香辛和调味蔬菜，而且具有重要的医疗保健价值。洋葱、大葱和大蒜耐储运，是我国重要的出口创汇蔬菜，而韭菜是人们逢年过节的传统蔬菜[1]。
分类学上的一致性，使得它们都具有巨大的基因组[2]，各组织部位都含有丰富的多糖物质[3]。多糖的理化性质与RNA极为相似，在沉淀RNA时，多糖也会随之沉淀，严重影响了RNA的提取质量。而多糖去除不净将严重影响RNA高通量测序分析、Northern杂交分析、RT-PCR、cDNA文库构建等下游的分子生物学操作[4]。传统提取RNA的方法有热酚法[5，6]、异硫氰酸胍法[7]、CTAB法[8，9]、SDS法[10，11]等，这些方法均具有各自的优缺点，单一的方法无法满足葱属蔬菜作物高质量RNA提取的需求。DEPC作为RNase清除剂广泛应用于RNA提取过程中，但其本身是一种强致癌物质，存在严重的安全隱患[12]。此外，DNA残留也是葱属蔬菜作物高质量RNA提取的难点。
针对上述问题，本研究将经典的CTAB法和异硫氰酸胍（GT）法有机结合起来，利用CTAB法去除多糖、酸性GT试剂（主要包含异硫氰酸胍）去除DNA污染以及低浓度的蛋白酶K（1 μg/mL）作为RNase清除剂替代强致癌物质DEPC[12]，对葱属蔬菜作物进行RNA提取，以期获得高质量的RNA样本。
1材料与方法
1.1试验材料
洋葱、大葱、大蒜和韭菜的叶片、鳞茎和花蕾，均取自山东省农业科学院蔬菜花卉试验基地，液氮速冻后-80°C超低温冰箱保存备用。
1.2试剂
蛋白酶K购置于宝生物工程（大连）有限公司，提取用生化试剂购置于生工生物工程（上海）股份有限公司，RT-PCR相关试剂购置于北京全式金生物技术有限公司。主要试剂配制方法：（1）RNA处理水：50 μL蛋白酶K（20 mg/mL）溶于1 L超纯水中，至终浓度为1 μg/mL；（2）LiCl溶液（8 mol/L）：17 g LiCl溶于50 mL RNA处理水；（3）CTAB提取液：0.25 mol/L Tris-HCl （pH 8.0），0.05 mol/L EDTA （pH 8.0），2.5 mol/L NaCl，2%CTAB，3%PVP-40，使用时加入巯基乙醇至终浓度为0.2%；（4）GT变性液：称取0.7764 g柠檬酸钠，溶解于50 mL水中（此时pH约为9.5左右），用盐酸调节pH为7.0，盐酸用量约为35 μL，加入0.528 g十二烷基肌氨酸钠，高温灭菌后加入异硫氰酸胍50 g，巯基乙醇0.2 mL，8-羟基喹啉0.1 g，定容至100 mL。 1.3提取方法
1.3.1改良CTAB法[8，9]（1）取供试组织材料液氮研磨并将粉末转移到CTAB裂解液（w∶v为1∶5）中，用时提前加入β-巯基乙醇至0.2%，涡旋混匀60 s，65℃水浴5～10 min，每隔2 min混匀一次，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），静置2～5 min；（2）12 000 r/min 4℃离心10 min，转移上清到新的离心管中，加入1/3体积8 mol/L LiCl，-20℃沉淀至少30 min；（3）12 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清，RNA沉于管底；（4）75%乙醇涡旋洗涤，12 000 r/min 4℃离心5 min，重复（4）后，室温干燥5 min，用高温处理的蛋白酶K水溶解。
1.3.2改良GT法[7]（1）取供试组织材料液氮研磨并将粉末转移到GT 变性液（w∶v为1∶5）中，用时提前加入β-巯基乙醇至0.2%，涡旋混匀60 s，室温放置5～10 min，加入1/10体积的2 mol/L醋酸钠（pH=4.0）剧烈混匀，加入与裂解液等体积的水饱和酚剧烈混匀，静置2～5 min，加入1/5体积氯仿∶异戊醇（24∶1）剧烈混匀，静置2～5 min；（2）12 000 r/min 4℃离心10 min，转移上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，静置5～10 min；以下同1.3.1中的（3）和（4）。
1.3.3GT-CTAB连用法将1.3.2改良GT法（3）中获得的RNA沉淀，用75%乙醇洗涤一次，加入CTAB裂解液约600 μL于65℃水浴溶解，再下同1.3.1。
1.3.4CTAB-GT连用法将1.3.1改良CTAB法（3）中获得的RNA沉淀，用75%乙醇洗涤一次，加入GT裂解液约600 μL于室温溶解，再下同1.3.2。
1.4检测方法
琼脂糖凝胶电泳检测，将电泳槽置于含冰水混合物的容器中，进行普通TBE琼脂糖凝胶电泳，电压20 V/cm，电泳25 min，EB染色，BIO-RAD凝胶成像系统拍照。采用安捷伦2100芯片生物分析仪检测RNA完整性、OD值及浓度。
2结果与分析
2.1四种提取方法对洋葱叶片总RNA提取质量的影响
由图1可以看出，四种方法均能够提出洋葱叶片的总RNA，GT和CTAB法点样孔中存在大量的多糖或蛋白质杂质，特别是GT法中点样孔更亮，而且所提取的样本粘稠，推测为多糖；CTAB法中虽然LiCl能选择性地沉淀RNA，然而样本中仍然存在大量的DNA残留，这也是许多文献中报道的LiCl沉淀RNA后必须用DNase处理样本的原因[8]。为了验证LiCl对DNA也具有沉淀效果，我们将一份DNA溶液平均分成两份（各300 μL），其中一份用经典的异丙醇沉淀法沉淀DNA，另一份用1/3体积即100 μL 8 mol/L的LiCl进行沉淀，结果（图2）表明，异丙醇和LiCl均能有效地沉淀DNA，异丙醇沉淀DNA的效率大于LiCl。
GT-CTAB和CTAB-GT法连用时获得了高质量RNA样本，然而在进行实际操作时，GT法获得的沉淀由于含有大量的多糖、蛋白质以及其他次生代谢产物很难溶解，而CTAB法获得的沉淀却极易溶解，因此，后续试验采用了CTAB-GT法。由图1还可以看出，GT法中5S rRNA的亮度显著高于LiCl沉淀的其他样本，这也表明LiCl对低分子量RNA的沉淀效率明显低于高分子量样本。
由表1可以看出，四种方法提取的RNA样本，其RIN（RNA Integrity Number）值均大于7.0，28S/18S均不小于1.4，基本达到了后续试验（特别是高通量测序）的要求。前两种方法28S/18S值较低的原因可能是蛋白质去除不彻底导致其干扰了测定结果或者部分RNA样本发生了降解。从OD260/OD280和OD260/OD230比值可以得出，GT法所获得的RNA中存在大量的多糖干扰，而CTAB法获得的RNA存在蛋白质或者盐离子污染。从浓度和产率来分析，GT法最高，之后依次是CTAB、CTAB-GT和GT-CTAB，在后两种方法中产率的差异可能是GT法中沉淀产物很难溶解造成的。从样品状态可以看出，GT和CTAB法提取的RNA均为粘稠状态。而图1中的CTAB法提取的RNA，存在大量的DNA污染，因此GT和CTAB法单独使用所获得的RNA均不适合后续高质量RNA需求的分子实验操作（如高通量测序建库），故选择CTAB-GT法作为后续的试验方法。
为了验证四种方法所获得的RNA能否用于RT-PCR试验，我们分别将其反转录后利用洋葱TUB引物进行PCR扩增（29个循环）。图3表明，GT、CTAB、GT-CTAB和CTAB-GT四种方法用于RT-PCR试验均可获得扩增产物，但CTAB和GT-CTAB法以LiCl作为沉淀剂导致扩增产物急剧降低，而将RNA样本用75%乙醇洗涤3次后，扩增效果恢复到与其他方法无可见差异状态，由此可以看出，LiCl干扰了反转录反应，降低了反转录效率。因此，在利用LiCl作为最终沉淀剂获取RNA时必须对样本进行多次洗涤，以尽可能降低其对后续分子生物学实验的影响。
2.3CTAB-GT连用法在葱属主要蔬菜作物不同組织部位RNA提取中的应用评估
为了验证CTAB-GT连用法对葱属主要蔬菜作物RNA样本提取的适用性，我们分别提取了洋葱、大葱、韭菜和大蒜样本的花蕾、茎（或假茎）和叶片的总RNA。由图4可以看出，点样孔清晰，表明无蛋白或多糖残留；DNA带不可见，表明几乎无DNA残留；28S和18S清晰，且28S的亮度约为18S的两倍，表明RNA样本完整。因此，该方法可以用于多个葱属蔬菜作物不同部位RNA样本的提取试验，特别是该方法对样本取量无限制，既可以对少量或微量样本提取，进行普通的RT-PCR试验，也可以对大量的样本提取，进行高通量测序及杂交分析等。 a：3讨论与结论
采用改良的CTAB-GT连用、蛋白酶K替代DEPC和冰浴电泳检测方法，解决了葱属蔬菜作物RNA提取过程中多糖干扰的难题。该方法所提取的RNA样本产量高，条带清晰，RNA完整度高，无多糖、蛋白质和DNA残留，28S约为18S两倍，可满足下游RNA分子实验（特别是高通量测序建库）的要求，且该方法适合于大葱、洋葱、大蒜和韭菜不同组织部位样本RNA的提取。
该方法首先采用改良CTAB法进行RNA的粗提，去除多糖残留，然后利用改良GT法对样本进行纯化，去除蛋白质和DNA残留。CTAB法中的LiCl虽然可选择性沉淀RNA，但试验结果表明LiCl同样可以沉淀DNA和部分蛋白质，而酸酚可以有效地去除蛋白质并使DNA溶解于有机相从而获得高质量的RNA。蛋白酶K（1 μg/mL）的使用更是取代了强致癌物质DEPC，降低了对于实验人员的安全隐患[12]，且未发现对RNA后续试验的不利影响。在试验过程中应特别注意由于PVP与苯酚会产生结晶[7]，因此CTAB法中不能使用苯酚抽提，而GT法中不能使用PVP。
参考文献：
[1]何启伟. 山东葱蒜类蔬菜生产现状与前景展望[J]. 山东蔬菜， 2002（3）：2-3.
[2]Huo Y M， Miao J， Liu B J， et al. The expression of pectin methylesterase in onion flower buds is associated with the dominant male-fertility restoration allele[J]. Plant Breeding， 2012， 131（1）：211-216.
[3]黃钰， 李旭双， 陈典， 等. 分蘖洋葱叶片RNA提取方法的比较和分析[J]. 北方园艺， 2011（14）：111-113.
[4]Wan C Y， Wilkins T A. A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton （Gossypium hirsutum L.）[J]. Analytical Biochemistry， 1994， 223（1）：7-12.
[5]张七仙， 刘俊起， 李成霞， 等. 一种简捷的同时提取植物总DNA和总RNA的方法[J].
关键词：葱属蔬菜；RNA提取；多糖；CTAB-GT
中图分类号：S633+Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）09-0006-05
AbstractAllium vegetables （including Allium cepa， Allium fistulosum L. var. giganteum Makion， Allium sativum and Allium tuberosum Rottl. ex Spreng） are rich in polysaccharides and other secondary metabolites， which seriously affect the quality of extracted RNA. In this study， we compared and analyzed a variety of RNA extraction methods using onion leaves as samples， and obtained a set of method for RNA extraction from Allium vegetables. This method was comprised of CTAB-GT， Proteinase K instead of DEPC and ice bath gel electrophoresis. The yield of RNA samples was about 152.35 μg/gFW， the RNA integrity （RIN value） was about 7.5， the bands of gel electrophoresis were clear without contaminations of polysaccharides， protein and DNA residues， the ratio of 28S/18S was about 2 and the extraction process was safe without strong carcinogen of DEPC. The RNA quality was suitable for downstream molecular experiments. Besides， this method could be applied to the extractions of different tissues of welsh onion， onion， garlic and Chinese chives.
KeywordsAllium vegetables； RNA extraction； Polysaccharides； CTAB-GT
洋葱、大葱、大蒜和韭菜在APGⅢ分类系统中均为天门冬目石蒜科葱亚科葱属蔬菜作物，广泛种植于世界各地。它们不仅是人们餐桌上必备的香辛和调味蔬菜，而且具有重要的医疗保健价值。洋葱、大葱和大蒜耐储运，是我国重要的出口创汇蔬菜，而韭菜是人们逢年过节的传统蔬菜[1]。
分类学上的一致性，使得它们都具有巨大的基因组[2]，各组织部位都含有丰富的多糖物质[3]。多糖的理化性质与RNA极为相似，在沉淀RNA时，多糖也会随之沉淀，严重影响了RNA的提取质量。而多糖去除不净将严重影响RNA高通量测序分析、Northern杂交分析、RT-PCR、cDNA文库构建等下游的分子生物学操作[4]。传统提取RNA的方法有热酚法[5，6]、异硫氰酸胍法[7]、CTAB法[8，9]、SDS法[10，11]等，这些方法均具有各自的优缺点，单一的方法无法满足葱属蔬菜作物高质量RNA提取的需求。DEPC作为RNase清除剂广泛应用于RNA提取过程中，但其本身是一种强致癌物质，存在严重的安全隱患[12]。此外，DNA残留也是葱属蔬菜作物高质量RNA提取的难点。
针对上述问题，本研究将经典的CTAB法和异硫氰酸胍（GT）法有机结合起来，利用CTAB法去除多糖、酸性GT试剂（主要包含异硫氰酸胍）去除DNA污染以及低浓度的蛋白酶K（1 μg/mL）作为RNase清除剂替代强致癌物质DEPC[12]，对葱属蔬菜作物进行RNA提取，以期获得高质量的RNA样本。
1材料与方法
1.1试验材料
洋葱、大葱、大蒜和韭菜的叶片、鳞茎和花蕾，均取自山东省农业科学院蔬菜花卉试验基地，液氮速冻后-80°C超低温冰箱保存备用。
1.2试剂
蛋白酶K购置于宝生物工程（大连）有限公司，提取用生化试剂购置于生工生物工程（上海）股份有限公司，RT-PCR相关试剂购置于北京全式金生物技术有限公司。主要试剂配制方法：（1）RNA处理水：50 μL蛋白酶K（20 mg/mL）溶于1 L超纯水中，至终浓度为1 μg/mL；（2）LiCl溶液（8 mol/L）：17 g LiCl溶于50 mL RNA处理水；（3）CTAB提取液：0.25 mol/L Tris-HCl （pH 8.0），0.05 mol/L EDTA （pH 8.0），2.5 mol/L NaCl，2%CTAB，3%PVP-40，使用时加入巯基乙醇至终浓度为0.2%；（4）GT变性液：称取0.7764 g柠檬酸钠，溶解于50 mL水中（此时pH约为9.5左右），用盐酸调节pH为7.0，盐酸用量约为35 μL，加入0.528 g十二烷基肌氨酸钠，高温灭菌后加入异硫氰酸胍50 g，巯基乙醇0.2 mL，8-羟基喹啉0.1 g，定容至100 mL。 1.3提取方法
1.3.1改良CTAB法[8，9]（1）取供试组织材料液氮研磨并将粉末转移到CTAB裂解液（w∶v为1∶5）中，用时提前加入β-巯基乙醇至0.2%，涡旋混匀60 s，65℃水浴5～10 min，每隔2 min混匀一次，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），静置2～5 min；（2）12 000 r/min 4℃离心10 min，转移上清到新的离心管中，加入1/3体积8 mol/L LiCl，-20℃沉淀至少30 min；（3）12 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清，RNA沉于管底；（4）75%乙醇涡旋洗涤，12 000 r/min 4℃离心5 min，重复（4）后，室温干燥5 min，用高温处理的蛋白酶K水溶解。
1.3.2改良GT法[7]（1）取供试组织材料液氮研磨并将粉末转移到GT 变性液（w∶v为1∶5）中，用时提前加入β-巯基乙醇至0.2%，涡旋混匀60 s，室温放置5～10 min，加入1/10体积的2 mol/L醋酸钠（pH=4.0）剧烈混匀，加入与裂解液等体积的水饱和酚剧烈混匀，静置2～5 min，加入1/5体积氯仿∶异戊醇（24∶1）剧烈混匀，静置2～5 min；（2）12 000 r/min 4℃离心10 min，转移上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，静置5～10 min；以下同1.3.1中的（3）和（4）。
1.3.3GT-CTAB连用法将1.3.2改良GT法（3）中获得的RNA沉淀，用75%乙醇洗涤一次，加入CTAB裂解液约600 μL于65℃水浴溶解，再下同1.3.1。
1.3.4CTAB-GT连用法将1.3.1改良CTAB法（3）中获得的RNA沉淀，用75%乙醇洗涤一次，加入GT裂解液约600 μL于室温溶解，再下同1.3.2。
1.4检测方法
琼脂糖凝胶电泳检测，将电泳槽置于含冰水混合物的容器中，进行普通TBE琼脂糖凝胶电泳，电压20 V/cm，电泳25 min，EB染色，BIO-RAD凝胶成像系统拍照。采用安捷伦2100芯片生物分析仪检测RNA完整性、OD值及浓度。
2结果与分析
2.1四种提取方法对洋葱叶片总RNA提取质量的影响
由图1可以看出，四种方法均能够提出洋葱叶片的总RNA，GT和CTAB法点样孔中存在大量的多糖或蛋白质杂质，特别是GT法中点样孔更亮，而且所提取的样本粘稠，推测为多糖；CTAB法中虽然LiCl能选择性地沉淀RNA，然而样本中仍然存在大量的DNA残留，这也是许多文献中报道的LiCl沉淀RNA后必须用DNase处理样本的原因[8]。为了验证LiCl对DNA也具有沉淀效果，我们将一份DNA溶液平均分成两份（各300 μL），其中一份用经典的异丙醇沉淀法沉淀DNA，另一份用1/3体积即100 μL 8 mol/L的LiCl进行沉淀，结果（图2）表明，异丙醇和LiCl均能有效地沉淀DNA，异丙醇沉淀DNA的效率大于LiCl。
GT-CTAB和CTAB-GT法连用时获得了高质量RNA样本，然而在进行实际操作时，GT法获得的沉淀由于含有大量的多糖、蛋白质以及其他次生代谢产物很难溶解，而CTAB法获得的沉淀却极易溶解，因此，后续试验采用了CTAB-GT法。由图1还可以看出，GT法中5S rRNA的亮度显著高于LiCl沉淀的其他样本，这也表明LiCl对低分子量RNA的沉淀效率明显低于高分子量样本。
由表1可以看出，四种方法提取的RNA样本，其RIN（RNA Integrity Number）值均大于7.0，28S/18S均不小于1.4，基本达到了后续试验（特别是高通量测序）的要求。前两种方法28S/18S值较低的原因可能是蛋白质去除不彻底导致其干扰了测定结果或者部分RNA样本发生了降解。从OD260/OD280和OD260/OD230比值可以得出，GT法所获得的RNA中存在大量的多糖干扰，而CTAB法获得的RNA存在蛋白质或者盐离子污染。从浓度和产率来分析，GT法最高，之后依次是CTAB、CTAB-GT和GT-CTAB，在后两种方法中产率的差异可能是GT法中沉淀产物很难溶解造成的。从样品状态可以看出，GT和CTAB法提取的RNA均为粘稠状态。而图1中的CTAB法提取的RNA，存在大量的DNA污染，因此GT和CTAB法单独使用所获得的RNA均不适合后续高质量RNA需求的分子实验操作（如高通量测序建库），故选择CTAB-GT法作为后续的试验方法。
为了验证四种方法所获得的RNA能否用于RT-PCR试验，我们分别将其反转录后利用洋葱TUB引物进行PCR扩增（29个循环）。图3表明，GT、CTAB、GT-CTAB和CTAB-GT四种方法用于RT-PCR试验均可获得扩增产物，但CTAB和GT-CTAB法以LiCl作为沉淀剂导致扩增产物急剧降低，而将RNA样本用75%乙醇洗涤3次后，扩增效果恢复到与其他方法无可见差异状态，由此可以看出，LiCl干扰了反转录反应，降低了反转录效率。因此，在利用LiCl作为最终沉淀剂获取RNA时必须对样本进行多次洗涤，以尽可能降低其对后续分子生物学实验的影响。
2.3CTAB-GT连用法在葱属主要蔬菜作物不同組织部位RNA提取中的应用评估
为了验证CTAB-GT连用法对葱属主要蔬菜作物RNA样本提取的适用性，我们分别提取了洋葱、大葱、韭菜和大蒜样本的花蕾、茎（或假茎）和叶片的总RNA。由图4可以看出，点样孔清晰，表明无蛋白或多糖残留；DNA带不可见，表明几乎无DNA残留；28S和18S清晰，且28S的亮度约为18S的两倍，表明RNA样本完整。因此，该方法可以用于多个葱属蔬菜作物不同部位RNA样本的提取试验，特别是该方法对样本取量无限制，既可以对少量或微量样本提取，进行普通的RT-PCR试验，也可以对大量的样本提取，进行高通量测序及杂交分析等。 a：3讨论与结论
采用改良的CTAB-GT连用、蛋白酶K替代DEPC和冰浴电泳检测方法，解决了葱属蔬菜作物RNA提取过程中多糖干扰的难题。该方法所提取的RNA样本产量高，条带清晰，RNA完整度高，无多糖、蛋白质和DNA残留，28S约为18S两倍，可满足下游RNA分子实验（特别是高通量测序建库）的要求，且该方法适合于大葱、洋葱、大蒜和韭菜不同组织部位样本RNA的提取。
该方法首先采用改良CTAB法进行RNA的粗提，去除多糖残留，然后利用改良GT法对样本进行纯化，去除蛋白质和DNA残留。CTAB法中的LiCl虽然可选择性沉淀RNA，但试验结果表明LiCl同样可以沉淀DNA和部分蛋白质，而酸酚可以有效地去除蛋白质并使DNA溶解于有机相从而获得高质量的RNA。蛋白酶K（1 μg/mL）的使用更是取代了强致癌物质DEPC，降低了对于实验人员的安全隐患[12]，且未发现对RNA后续试验的不利影响。在试验过程中应特别注意由于PVP与苯酚会产生结晶[7]，因此CTAB法中不能使用苯酚抽提，而GT法中不能使用PVP。
参考文献：
[1]何启伟. 山东葱蒜类蔬菜生产现状与前景展望[J]. 山东蔬菜， 2002（3）：2-3.
[2]Huo Y M， Miao J， Liu B J， et al. The expression of pectin methylesterase in onion flower buds is associated with the dominant male-fertility restoration allele[J]. Plant Breeding， 2012， 131（1）：211-216.
[3]黃钰， 李旭双， 陈典， 等. 分蘖洋葱叶片RNA提取方法的比较和分析[J]. 北方园艺， 2011（14）：111-113.
[4]Wan C Y， Wilkins T A. A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton （Gossypium hirsutum L.）[J]. Analytical Biochemistry， 1994， 223（1）：7-12.
[5]张七仙， 刘俊起， 李成霞， 等. 一种简捷的同时提取植物总DNA和总RNA的方法[J].