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摘 要 以巴西橡胶树花药为外植体，研究了巴西橡胶树花药体胚发生过程中抗氧化酶活性和某些生理参数的变化。结果表明，橡胶树花药体胚发生过程中，SOD活性变化表现在培养30 d达到最高值，而后下降平缓；丙二醛（MDA）含量在第60天达到最高。生理参数的变化表现为可溶性蛋白含量0 d含量最高，可溶性糖的含量在50 d达到最高，据此认为，SOD和MDA对橡胶树花药体胚的诱导起主导作用，可溶性蛋白含量与不定芽的发生密切相关。
关键词 巴西橡胶树 ；体胚发生 ；抗氧化酶活性 ；可溶性蛋白含量
分类号 S794.1
植物离体培养过程中体细胞胚胎的发生，是由愈伤组织先形成胚状体，再由胚状体发育成完整植株，其生理生化特征的改变，是植物外植体外部形态特征的外部反映，这些变化决定着外植体发育的方向[1]。本研究以巴西橡胶树花药为外植体，在适合的培养基中诱导产生体胚，在体胚不同发育时期测定其生理生化指标，以探索其生理生化特性，对于橡胶树体细胞胚发生研究具有重要意义。
SOD是重要的抗氧化酶，其活性的高低能直接反映植物清除活性氧能力的大小[2]。SOD主要清除超氧化物阴离子自由基，POD和CAT主要清除H2O2，三种酶相互作用可以有效清除活性氧，并防止膜脂过氧化。许多学者研究表明，外植体抗氧化酶活性的变化与外植体细胞的分化有直接的关系[3-6]。细胞膜脂过氧化水平的程度，MDA是重要衡量指标，又是一种能强烈的与细胞内各种成分发生反应的主要物质，因而引起酶和膜的严重损伤，膜电阻及膜的流动性降低，最终导致了膜结构及生理完整性的破坏[7]。当活性氧积累超过抗氧化酶系统的清除能力时，导致活性氧及丙二醛（MDA）积累，导致膜透性增大[8-9]。
本研究以巴西橡胶树花药体胚的诱导发生为基础进行组织培养，研究了巴西橡胶树花药体胚发生过程中外植体内部抗氧化酶活性和MDA含量的变化趋势，旨在探讨橡胶树体胚发生的生理生化机理，为巴西橡胶树花药再生体系的优化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料以巴西橡胶树优良无性系热研 7-33-97花药为试材，花药培养方法参照Hua等[10]的方法。
1.2 方法
1.2.1 生理参数测定
分别准确称取花药愈伤在体胚诱导培养基上培养0、10、20、30、40、50和60 d新鲜外植体材料0.2 g，在4℃预冷的研钵中，加入5 mL PBS缓冲液（pH7.8）研磨，使最终添加量为5 mL。10 000 r/min离心10 min，取上清液冷藏于冰盒中，用于各项生理指标的测定。重复3次。
采用NBT光化还原法测定SOD活性[11]。以SOD抑制NBT的光化学还原50%时的酶用量为一个酶活性单位。
采用考马斯亮兰G-250法测定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白做标准曲线，计算各样品的蛋白质浓度。采用蒽酮法测定可溶性糖[12]。采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量，参照张志良[13]的方法，计算MDA含量。
1.2.2 数据分析
数据采用Excel 2007软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 巴西橡胶树花药体胚发生过程中SOD活性的变化
SOD（超氧化物歧化酶）是需氧生物中普遍存在的一种酶，它能够防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害。从图1可知，即在培养初期，外植体超氧化物歧化酶（SOD）活性最低，第30天出现最高峰，由于此阶段愈伤组织开始形成体胚，体积增大，外植体对营养物质的需求逐渐增加而使SOD活性呈上升趋势[14]。而此时正是心形体胚生长的时期，这说明SOD活性升高对早期子叶胚的发生有促进作用。在培养的40～60 d，外植体组织处于旺盛的生长阶段，SOD活性逐渐下降。
2.2 MDA含量的变化
丙二醛（MDA）含量能反应细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标之一[15]。在巴西橡胶树花药体胚的诱导过程中，MDA含量变化较大（图2）。在第60天达到最高，这可能也与其再生产生不定芽相关，但MDA含量20～50 d总体差异不是很大。
2.3 可溶性蛋白含量的变化
随着愈伤组织的进一步发育，其可溶性蛋白含量也发生一定的变化。由图3可以看出，可溶性蛋白含量最高值出现在0 d，随后下降。在培养的20、30 d出现小高峰。可溶性蛋白含量峰值的高低及出现时间的不同，与体胚的生长也有重要关系，在培养的初期，即愈伤时期，蛋白含量最高，之后随着愈伤组织的生长而变化。
2.4 可溶性糖含量的变化
测定可溶性糖含量结果表明，在体胚发生阶段，从0 d开始可溶性糖含量出现上升，但速度缓慢，在第50天达到含量最高，而后下降，而此时正是子叶胚时期。可见，子叶胚形成后，可溶性糖含量明显下降。
3 讨论
巴西橡胶树花药体胚的发生是一个极其复杂的过程，伴随着一系列的外植体生理生化变化，这些变化在形态转变之前已经发生。许多研究表明，SOD是植物体内氧代谢的关键酶，是细胞的一种保护酶和诱导酶[14]。本试验研究结果表明，SOD活性的高峰在愈伤组织培养第30天出现，与关正君[15]、何梦玲[16]试验结果相似。这可能是巴西橡胶树愈伤组织初始阶段形成过程中过多的氧自由基，SOD酶可用于清除这些自由基，致使代谢水平和呼吸作用增强。而后随着花药体胚的旺盛生长，多余的超氧自由基被还原为H2O，不断减少的超氧自由基，使得SOD活性变化较为缓慢，并且呈现出下降趋势。由于外植体对培养环境的适应，所以受到外部环境条件的影响，SOD酶活性也在发生变化，这也是在出现了高峰后伴随酶活性下降的原因。
可溶性蛋白质含量的高低可以间接反映出细胞各种代谢活动的强弱，在植物组织培养中中起着重要的作用[4]。本研究发现，在花药外植体培养30 d后，外植体内可溶性蛋白质含量呈下降趋势，并且可溶性蛋白呈现最高值，这可能是由于细胞内原有的可溶性蛋白质转变为细胞启动时所需的物质，并且新的蛋白质还未合成。当细胞开始分裂增殖时，细胞内开始合成可溶性蛋白质，因此升高，30 d时，随愈伤组织衰老时又降低。丙二醛（MDA）含量体现在培养60 d时最高，可见与子叶胚形成有关。
碳水化合物在植物体胚发生过程中起着重要的作用。本研究发现，可溶性糖含量培养前期含量缓慢上升，而培养50 d后，开始下降。表明可溶性糖含量与子叶胚形成关系密切。陈陆琴等[17]研究发现，合欢、金莲花茎尖从愈伤组织分化出芽，在前12 d的培养中，糖含量呈现迅速增长的趋势，而后糖含量逐渐下降。这可能是由于可溶性糖作为外植体分化细胞的碳骨架原料，愈伤组织增殖时，需要更高的糖来提供原料供应。
参考文献
[1] 王 熊.激素对植物培养细胞生化的调节作用[J]. 细胞生物学，1983，3（5）：40-45.
[2] Fridovich I.The biology of oxygen radical，the supemxide radical is an agent of oxygen toxicity：superoxide dismutase provide an important defence[J]. Science， 1978， 201： 875-880.
[3] 崔凯荣，任红旭，邢更生，等.枸杞组织培养中抗氧化酶活性与体细胞胚发生相关性的研究[J].兰州大学学报（自然科学版），1998，34（3）：93-99.
[4] 王敬文，蒋 晶. 低温驯化的黑荆树悬浮培养细胞中可溶性蛋白含量变化[J]. 林业科学研究，1993，6（6）：661-665.
[5] 崔凯荣，王晓哲，陈 雄，等. 小麦体细胞胚发生中DNA、RNA和蛋白质的合成动态[J]. 核农学报，1997，11（4）：209-214.
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关键词 巴西橡胶树 ；体胚发生 ；抗氧化酶活性 ；可溶性蛋白含量
分类号 S794.1
植物离体培养过程中体细胞胚胎的发生，是由愈伤组织先形成胚状体，再由胚状体发育成完整植株，其生理生化特征的改变，是植物外植体外部形态特征的外部反映，这些变化决定着外植体发育的方向[1]。本研究以巴西橡胶树花药为外植体，在适合的培养基中诱导产生体胚，在体胚不同发育时期测定其生理生化指标，以探索其生理生化特性，对于橡胶树体细胞胚发生研究具有重要意义。
SOD是重要的抗氧化酶，其活性的高低能直接反映植物清除活性氧能力的大小[2]。SOD主要清除超氧化物阴离子自由基，POD和CAT主要清除H2O2，三种酶相互作用可以有效清除活性氧，并防止膜脂过氧化。许多学者研究表明，外植体抗氧化酶活性的变化与外植体细胞的分化有直接的关系[3-6]。细胞膜脂过氧化水平的程度，MDA是重要衡量指标，又是一种能强烈的与细胞内各种成分发生反应的主要物质，因而引起酶和膜的严重损伤，膜电阻及膜的流动性降低，最终导致了膜结构及生理完整性的破坏[7]。当活性氧积累超过抗氧化酶系统的清除能力时，导致活性氧及丙二醛（MDA）积累，导致膜透性增大[8-9]。
本研究以巴西橡胶树花药体胚的诱导发生为基础进行组织培养，研究了巴西橡胶树花药体胚发生过程中外植体内部抗氧化酶活性和MDA含量的变化趋势，旨在探讨橡胶树体胚发生的生理生化机理，为巴西橡胶树花药再生体系的优化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料以巴西橡胶树优良无性系热研 7-33-97花药为试材，花药培养方法参照Hua等[10]的方法。
1.2 方法
1.2.1 生理参数测定
分别准确称取花药愈伤在体胚诱导培养基上培养0、10、20、30、40、50和60 d新鲜外植体材料0.2 g，在4℃预冷的研钵中，加入5 mL PBS缓冲液（pH7.8）研磨，使最终添加量为5 mL。10 000 r/min离心10 min，取上清液冷藏于冰盒中，用于各项生理指标的测定。重复3次。
采用NBT光化还原法测定SOD活性[11]。以SOD抑制NBT的光化学还原50%时的酶用量为一个酶活性单位。
采用考马斯亮兰G-250法测定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白做标准曲线，计算各样品的蛋白质浓度。采用蒽酮法测定可溶性糖[12]。采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量，参照张志良[13]的方法，计算MDA含量。
1.2.2 数据分析
数据采用Excel 2007软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 巴西橡胶树花药体胚发生过程中SOD活性的变化
SOD（超氧化物歧化酶）是需氧生物中普遍存在的一种酶，它能够防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害。从图1可知，即在培养初期，外植体超氧化物歧化酶（SOD）活性最低，第30天出现最高峰，由于此阶段愈伤组织开始形成体胚，体积增大，外植体对营养物质的需求逐渐增加而使SOD活性呈上升趋势[14]。而此时正是心形体胚生长的时期，这说明SOD活性升高对早期子叶胚的发生有促进作用。在培养的40～60 d，外植体组织处于旺盛的生长阶段，SOD活性逐渐下降。
2.2 MDA含量的变化
丙二醛（MDA）含量能反应细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标之一[15]。在巴西橡胶树花药体胚的诱导过程中，MDA含量变化较大（图2）。在第60天达到最高，这可能也与其再生产生不定芽相关，但MDA含量20～50 d总体差异不是很大。
2.3 可溶性蛋白含量的变化
随着愈伤组织的进一步发育，其可溶性蛋白含量也发生一定的变化。由图3可以看出，可溶性蛋白含量最高值出现在0 d，随后下降。在培养的20、30 d出现小高峰。可溶性蛋白含量峰值的高低及出现时间的不同，与体胚的生长也有重要关系，在培养的初期，即愈伤时期，蛋白含量最高，之后随着愈伤组织的生长而变化。
2.4 可溶性糖含量的变化
测定可溶性糖含量结果表明，在体胚发生阶段，从0 d开始可溶性糖含量出现上升，但速度缓慢，在第50天达到含量最高，而后下降，而此时正是子叶胚时期。可见，子叶胚形成后，可溶性糖含量明显下降。
3 讨论
巴西橡胶树花药体胚的发生是一个极其复杂的过程，伴随着一系列的外植体生理生化变化，这些变化在形态转变之前已经发生。许多研究表明，SOD是植物体内氧代谢的关键酶，是细胞的一种保护酶和诱导酶[14]。本试验研究结果表明，SOD活性的高峰在愈伤组织培养第30天出现，与关正君[15]、何梦玲[16]试验结果相似。这可能是巴西橡胶树愈伤组织初始阶段形成过程中过多的氧自由基，SOD酶可用于清除这些自由基，致使代谢水平和呼吸作用增强。而后随着花药体胚的旺盛生长，多余的超氧自由基被还原为H2O，不断减少的超氧自由基，使得SOD活性变化较为缓慢，并且呈现出下降趋势。由于外植体对培养环境的适应，所以受到外部环境条件的影响，SOD酶活性也在发生变化，这也是在出现了高峰后伴随酶活性下降的原因。
可溶性蛋白质含量的高低可以间接反映出细胞各种代谢活动的强弱，在植物组织培养中中起着重要的作用[4]。本研究发现，在花药外植体培养30 d后，外植体内可溶性蛋白质含量呈下降趋势，并且可溶性蛋白呈现最高值，这可能是由于细胞内原有的可溶性蛋白质转变为细胞启动时所需的物质，并且新的蛋白质还未合成。当细胞开始分裂增殖时，细胞内开始合成可溶性蛋白质，因此升高，30 d时，随愈伤组织衰老时又降低。丙二醛（MDA）含量体现在培养60 d时最高，可见与子叶胚形成有关。
碳水化合物在植物体胚发生过程中起着重要的作用。本研究发现，可溶性糖含量培养前期含量缓慢上升，而培养50 d后，开始下降。表明可溶性糖含量与子叶胚形成关系密切。陈陆琴等[17]研究发现，合欢、金莲花茎尖从愈伤组织分化出芽，在前12 d的培养中，糖含量呈现迅速增长的趋势，而后糖含量逐渐下降。这可能是由于可溶性糖作为外植体分化细胞的碳骨架原料，愈伤组织增殖时，需要更高的糖来提供原料供应。
参考文献
[1] 王 熊.激素对植物培养细胞生化的调节作用[J]. 细胞生物学，1983，3（5）：40-45.
[2] Fridovich I.The biology of oxygen radical，the supemxide radical is an agent of oxygen toxicity：superoxide dismutase provide an important defence[J]. Science， 1978， 201： 875-880.
[3] 崔凯荣，任红旭，邢更生，等.枸杞组织培养中抗氧化酶活性与体细胞胚发生相关性的研究[J].兰州大学学报（自然科学版），1998，34（3）：93-99.
[4] 王敬文，蒋 晶. 低温驯化的黑荆树悬浮培养细胞中可溶性蛋白含量变化[J]. 林业科学研究，1993，6（6）：661-665.
[5] 崔凯荣，王晓哲，陈 雄，等. 小麦体细胞胚发生中DNA、RNA和蛋白质的合成动态[J]. 核农学报，1997，11（4）：209-214.
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