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摘要：目的：改良SD大鼠乳鼠心肌细胞培养的条件和方法，以分离得到更高纯度和存活率的心肌细胞。方法：取出生1～3d内SD大鼠的心室组织，采用胰蛋白酶和I型胶原酶多次消化心肌，差速贴壁培养2h，加BrdU抑制成纤维细胞进行纯化培养，并在生物倒置显微镜下观察形态学变化，培养72h后，用免疫组化法检测纯度。培养5、7、15、20、30d时，用台盼蓝染色法检测存活率。结果：培养24h左右的细胞之间形成交联并有搏动，培养72h的心肌细胞的纯度为98.2%，培养15d内存活率大于95.0%。结论：本实验应用改良并简化的心肌细胞培养方法可得到纯度和存活率较高的原代乳鼠心肌细胞，适合进一步推广。
关键词：SD大鼠 乳鼠 心肌细胞 原代培养
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.023
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）07-0025-02
体外培养的大鼠心肌细胞保留了基本结构和功能，不受体内神经、体液等的影响，被广泛用于心血管生物学、细胞电生理、药理毒理学等研究，足够纯度和活力的心肌细胞是保证完成这些实验的基础[1]。文献报道的心肌细胞培养的方法很多，但都较为复杂，导致培养得到的心肌细胞纯度、活力各不相同[2]。本研究结合前人的经验，对新生SD大鼠的心肌细胞原代培养方法进行了简化，以期培养出纯度较高、活力较强的大鼠心肌细胞。
1 材料和方法
1.1 材料。
1.1.1 实验动物。出生1～3d的SD大鼠，雌雄不拘，由南昌大学实验动物科学部提供。
1.1.2 材料与试剂。DMEM/F12干粉培养基（DF培养基）、小牛血清、D-Hank’s液，5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu）、I型胶原酶购自Sigma公司；小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体（α-SA），山羊抗小鼠IgG购于武汉博士德微生物工程有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器。超净工作台（苏州净化设备有限公司），恒温二氧化碳培养箱（Thermo，德国），倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），2-16PK高速冷冻离心机（Sigma公司，德国），玻璃培养瓶、24孔培养板、200目网筛（上海博光生物科技有限公司）。
1.2 方法。
1.2.1 溶液配制。将DF培养基溶解于三蒸水中，加压过滤除菌，调整至pH7.2～7.4，于-20℃保存，临用前加入100ml/L小牛血清，即为DF培养液，用于细胞培养。将I型胶原酶和胰蛋白酶溶解于无血清的DF培养溶液中，配成含0.8g/L I型胶原酶和0.05%胰蛋白酶的溶液用于消化心肌组织。
1.2.2 心脏组织的获取、消化及培养。
（1）取出生1～3d的SD大鼠，75%酒精消毒皮肤后开胸，用眼科弯镊取心脏心尖部，置于预冷的D-Hank’s液中，剪除结缔组织，漂洗3次。
（2）取心尖部分的心室组织，用眼科剪剪成约大小约1mm3的小块，加入1mlDF培养液，用吸管吹打成组织悬液，转入培养瓶，用混合酶溶液消化，磁力37°C保温搅拌（50～60r/min）消化8min，弃去上清液。
（3）剩余组织块加混合酶溶液（每g心肌组织约需10ml）消化8min×5次，合并上清液，加DF培养液终止消化，过200目网筛，以1000r/min离心5min，收集沉淀，以DF培养液漂洗2次，置37℃、5%CO2培养箱中培养2h。
（4）采用差速贴壁分离技术，将2h后尚未贴壁的心肌细胞悬液在无菌条件下用吸管吸出，调整细胞浓度为5.0×105个/ml，将单细胞悬液接种于适当的培养器板中，首次24h后换液，之后隔日换液。
1.2.3 细胞形态学观察和存活率测定。取等量0.4%台盼蓝溶液与细胞悬液滴于细胞计数板上，死亡细胞蓝染，任选10个高倍视野，每个视野计数4个大格中细胞总数及阳性细胞数，存活率=活细胞数/细胞总数×100%，计数3次取平均。分别于培养的5、7、15、20、30d，计算细胞的存活率，并在倒置相差显微镜下观察心肌细胞的形态学变化。
1.2.4 细胞纯度鉴定。取培养72h的心肌细胞，采用以α-SA抗体为一抗、山羊抗小鼠IgG为二抗的免疫组织化学染色进行纯度鉴定，心肌细胞细胞核蓝染，胞质呈褐色，成纤维细胞因不含肌动蛋白而胞质不着色。镜下任选10个视野，每个视野计数4个大格中褐色胞质的细胞占总细胞数的比例（重复6次），确定心肌细胞的纯度。
1.2.5 统计学方法。实验中的数据采用SPSS12.0统计软件分析，所有数据均以X±S表示，多个样本均数间比较采用q检验，两组之间比较采用t检验。
2 结果
2.1 心肌细胞的纯度鉴定。培养72h后，以免疫荧光法检测，测定6次得到心肌细胞平均纯度为（98.2±0.8）%。
2.2 心肌细胞存活率的计算。不同培养时间点间的存活率均数之间两两比较，差异无统计学意义。第30d的存活率与第3d比较显著降低，P<0.05。（表1）。
表1 原代培养心肌细胞存活率
注：细胞总数为10000个，*与第5d比较，P<0.05。
2.3 心肌细胞的形态学观察。采用倒置相差显微镜观察，刚接种时细胞成圆形颗粒，折光性良好，悬浮于培养基中。培养2～4h后细胞开始贴壁，慢慢变为梭形，到12h左右伸出伪足，呈菱形、星形等形态，偶见细胞搏动。培养24h左右时，细胞贴壁完全呈梭形，有伪足，并在细胞间形成交联（图1A，B），可见自发性搏动，各个细胞频率、节律不同。48h后，逐渐形成细胞簇，细胞搏动较多（搏动频率5～90次/min不等），在细胞密度较大的部位可见多个细胞以同一频率搏动（图1C）。培养72h左右时，细胞交织成网，形成细胞单层或细胞簇，呈放射状，形态不规则，搏动同步，搏动的频率在（70～90）次/min，同一批细胞搏动频率一致（图1D）。3～20d内心肌细胞形态活力正常，20d后搏动率开始减少，30d后部分细胞停止搏动，细胞皱缩、脱落。 3 讨论
离体心肌细胞对于心血管生理、药理、代谢、分子生物学等方面的研究具有重要作用，然而心肌细胞增殖能力低，只有刚出生不久的乳鼠心肌细胞原代培养可得到大量高纯心肌细胞[3]。心肌细胞的分离主要有组织贴块法和酶消化法，酶消化法获得的细胞纯度较高，便于生物学观测和实验，应用更加广泛，但是对心肌细胞损伤大，导致获得的细胞活力不高[4]。
本研究对如何提高心肌细胞纯度、减少消化损伤进行了多次探索，总结经验如下：
（1）差速贴壁分离联合Brdu抑制法去除非心肌细胞。差速贴壁法操作简便、用时短、对细胞影响小，但不适于长期培养。加入Brdu培养48h可抑制成纤维细胞，对心肌细胞无毒性与抑制作用，可用于培养时间较长的实验。
（2）使用小牛血清而不用胎牛血清。血清的成分可影响细胞的存活时间和生长状态，胎牛血清含有大量有丝分裂因子，Brdu难以抑制成纤维细胞的生长，培养效果不如小牛血清。
（3）采用低浓度胰酶与I型胶原酶消化心肌细胞。文献中胰酶用量0.05%～0.25%不等，本研究发现高浓度胰酶会损伤心肌细胞间质，细胞死亡率增加，胰酶浓度过低，细胞聚集成团，得不到单个细胞。本实验采用0.8g/L I型胶原酶和0.05%胰蛋白酶消化心肌细胞，对心肌细胞损害小，且消化效率高。
（4）消化时间与次数。采取短时多次的方式加入消化酶，每次不超过8min，以减少对心肌细胞的损伤。
（5）30d后存活率明显降低。心肌细胞需在工作条件下才能保持活力，无负荷状态长期培养，会导致肌丝、线粒体减少，细胞萎缩[5]，因此培养的心肌细胞应在一定时间内使用。
总之，本实验应用改良并简化的心肌细胞培养方法可得到纯度和存活率较高的原代乳鼠心肌细胞，操作方便，重复性好，适合进一步推广。
参考文献
[1] 王瑞华，兰晓莉，曹国祥，等.新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化及改良[J].心脏杂志，2008，02：154-157
[2] 张晓京，张建栋，来丽娜，等.SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进[J].长治医学院学报，2012，03：171-173
[3] 郭军，鲍翠玉，林国生，等.新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[J].心血管康复医学杂志，2006，06：538-540
[4] 王涛，余志斌，谢满江，等.新生大鼠心肌细胞培养技巧[J].第四军医大学学报，2003，02：92
[5] 郝亚荣，李建军，李庚山，等.乳鼠心肌细胞的原代培养[J].心脏杂志，2001，06：473-475
关键词：SD大鼠 乳鼠 心肌细胞 原代培养
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.023
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）07-0025-02
体外培养的大鼠心肌细胞保留了基本结构和功能，不受体内神经、体液等的影响，被广泛用于心血管生物学、细胞电生理、药理毒理学等研究，足够纯度和活力的心肌细胞是保证完成这些实验的基础[1]。文献报道的心肌细胞培养的方法很多，但都较为复杂，导致培养得到的心肌细胞纯度、活力各不相同[2]。本研究结合前人的经验，对新生SD大鼠的心肌细胞原代培养方法进行了简化，以期培养出纯度较高、活力较强的大鼠心肌细胞。
1 材料和方法
1.1 材料。
1.1.1 实验动物。出生1～3d的SD大鼠，雌雄不拘，由南昌大学实验动物科学部提供。
1.1.2 材料与试剂。DMEM/F12干粉培养基（DF培养基）、小牛血清、D-Hank’s液，5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu）、I型胶原酶购自Sigma公司；小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体（α-SA），山羊抗小鼠IgG购于武汉博士德微生物工程有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器。超净工作台（苏州净化设备有限公司），恒温二氧化碳培养箱（Thermo，德国），倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），2-16PK高速冷冻离心机（Sigma公司，德国），玻璃培养瓶、24孔培养板、200目网筛（上海博光生物科技有限公司）。
1.2 方法。
1.2.1 溶液配制。将DF培养基溶解于三蒸水中，加压过滤除菌，调整至pH7.2～7.4，于-20℃保存，临用前加入100ml/L小牛血清，即为DF培养液，用于细胞培养。将I型胶原酶和胰蛋白酶溶解于无血清的DF培养溶液中，配成含0.8g/L I型胶原酶和0.05%胰蛋白酶的溶液用于消化心肌组织。
1.2.2 心脏组织的获取、消化及培养。
（1）取出生1～3d的SD大鼠，75%酒精消毒皮肤后开胸，用眼科弯镊取心脏心尖部，置于预冷的D-Hank’s液中，剪除结缔组织，漂洗3次。
（2）取心尖部分的心室组织，用眼科剪剪成约大小约1mm3的小块，加入1mlDF培养液，用吸管吹打成组织悬液，转入培养瓶，用混合酶溶液消化，磁力37°C保温搅拌（50～60r/min）消化8min，弃去上清液。
（3）剩余组织块加混合酶溶液（每g心肌组织约需10ml）消化8min×5次，合并上清液，加DF培养液终止消化，过200目网筛，以1000r/min离心5min，收集沉淀，以DF培养液漂洗2次，置37℃、5%CO2培养箱中培养2h。
（4）采用差速贴壁分离技术，将2h后尚未贴壁的心肌细胞悬液在无菌条件下用吸管吸出，调整细胞浓度为5.0×105个/ml，将单细胞悬液接种于适当的培养器板中，首次24h后换液，之后隔日换液。
1.2.3 细胞形态学观察和存活率测定。取等量0.4%台盼蓝溶液与细胞悬液滴于细胞计数板上，死亡细胞蓝染，任选10个高倍视野，每个视野计数4个大格中细胞总数及阳性细胞数，存活率=活细胞数/细胞总数×100%，计数3次取平均。分别于培养的5、7、15、20、30d，计算细胞的存活率，并在倒置相差显微镜下观察心肌细胞的形态学变化。
1.2.4 细胞纯度鉴定。取培养72h的心肌细胞，采用以α-SA抗体为一抗、山羊抗小鼠IgG为二抗的免疫组织化学染色进行纯度鉴定，心肌细胞细胞核蓝染，胞质呈褐色，成纤维细胞因不含肌动蛋白而胞质不着色。镜下任选10个视野，每个视野计数4个大格中褐色胞质的细胞占总细胞数的比例（重复6次），确定心肌细胞的纯度。
1.2.5 统计学方法。实验中的数据采用SPSS12.0统计软件分析，所有数据均以X±S表示，多个样本均数间比较采用q检验，两组之间比较采用t检验。
2 结果
2.1 心肌细胞的纯度鉴定。培养72h后，以免疫荧光法检测，测定6次得到心肌细胞平均纯度为（98.2±0.8）%。
2.2 心肌细胞存活率的计算。不同培养时间点间的存活率均数之间两两比较，差异无统计学意义。第30d的存活率与第3d比较显著降低，P<0.05。（表1）。
表1 原代培养心肌细胞存活率
注：细胞总数为10000个，*与第5d比较，P<0.05。
2.3 心肌细胞的形态学观察。采用倒置相差显微镜观察，刚接种时细胞成圆形颗粒，折光性良好，悬浮于培养基中。培养2～4h后细胞开始贴壁，慢慢变为梭形，到12h左右伸出伪足，呈菱形、星形等形态，偶见细胞搏动。培养24h左右时，细胞贴壁完全呈梭形，有伪足，并在细胞间形成交联（图1A，B），可见自发性搏动，各个细胞频率、节律不同。48h后，逐渐形成细胞簇，细胞搏动较多（搏动频率5～90次/min不等），在细胞密度较大的部位可见多个细胞以同一频率搏动（图1C）。培养72h左右时，细胞交织成网，形成细胞单层或细胞簇，呈放射状，形态不规则，搏动同步，搏动的频率在（70～90）次/min，同一批细胞搏动频率一致（图1D）。3～20d内心肌细胞形态活力正常，20d后搏动率开始减少，30d后部分细胞停止搏动，细胞皱缩、脱落。 3 讨论
离体心肌细胞对于心血管生理、药理、代谢、分子生物学等方面的研究具有重要作用，然而心肌细胞增殖能力低，只有刚出生不久的乳鼠心肌细胞原代培养可得到大量高纯心肌细胞[3]。心肌细胞的分离主要有组织贴块法和酶消化法，酶消化法获得的细胞纯度较高，便于生物学观测和实验，应用更加广泛，但是对心肌细胞损伤大，导致获得的细胞活力不高[4]。
本研究对如何提高心肌细胞纯度、减少消化损伤进行了多次探索，总结经验如下：
（1）差速贴壁分离联合Brdu抑制法去除非心肌细胞。差速贴壁法操作简便、用时短、对细胞影响小，但不适于长期培养。加入Brdu培养48h可抑制成纤维细胞，对心肌细胞无毒性与抑制作用，可用于培养时间较长的实验。
（2）使用小牛血清而不用胎牛血清。血清的成分可影响细胞的存活时间和生长状态，胎牛血清含有大量有丝分裂因子，Brdu难以抑制成纤维细胞的生长，培养效果不如小牛血清。
（3）采用低浓度胰酶与I型胶原酶消化心肌细胞。文献中胰酶用量0.05%～0.25%不等，本研究发现高浓度胰酶会损伤心肌细胞间质，细胞死亡率增加，胰酶浓度过低，细胞聚集成团，得不到单个细胞。本实验采用0.8g/L I型胶原酶和0.05%胰蛋白酶消化心肌细胞，对心肌细胞损害小，且消化效率高。
（4）消化时间与次数。采取短时多次的方式加入消化酶，每次不超过8min，以减少对心肌细胞的损伤。
（5）30d后存活率明显降低。心肌细胞需在工作条件下才能保持活力，无负荷状态长期培养，会导致肌丝、线粒体减少，细胞萎缩[5]，因此培养的心肌细胞应在一定时间内使用。
总之，本实验应用改良并简化的心肌细胞培养方法可得到纯度和存活率较高的原代乳鼠心肌细胞，操作方便，重复性好，适合进一步推广。
参考文献
[1] 王瑞华，兰晓莉，曹国祥，等.新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化及改良[J].心脏杂志，2008，02：154-157
[2] 张晓京，张建栋，来丽娜，等.SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进[J].长治医学院学报，2012，03：171-173
[3] 郭军，鲍翠玉，林国生，等.新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[J].心血管康复医学杂志，2006，06：538-540
[4] 王涛，余志斌，谢满江，等.新生大鼠心肌细胞培养技巧[J].第四军医大学学报，2003，02：92
[5] 郝亚荣，李建军，李庚山，等.乳鼠心肌细胞的原代培养[J].心脏杂志，2001，06：473-475